Micro-CT con contrasto per valutare il debridement del tessuto pulpare nei canali radicolari di denti estratti: una serie di esperimenti a cascata verso la validazione del metodo

Abstract

Obiettivo: Validare un nuovo metodo per la valutazione della detersione del tessuto pulpare nei canali radicolari dei denti estratti utilizzando un protocollo di impregnazione che coinvolge il triioduro di potassio, una soluzione radiocontrastante nota come Lugol, combinata con l'imaging micro-tomografico (micro-CT).

Metodologia: L'impatto del NaOCl sulla radiopacità della soluzione di Lugol è stato valutato utilizzando una serie di diluizioni in due fasi di Lugol in acqua distillata e NaOCl al 5,25%, che sono stati poi pipettati in piatti trasparenti e radiografati. Per verificare l'influenza di Lugol sull'effetto proteolitico del NaOCl, è stato eseguito un test di dissoluzione utilizzando carne bovina fresca. Dieci fette non hanno subito alcun trattamento del tessuto, mentre venti fette sono state fissate in formaldeide per 24 ore. Dopo di che, 10 di esse sono state immerse in Lugol per altre 24 ore. Successivamente, tutti i campioni sono stati posti in NaOCl e il tempo necessario per una completa dissoluzione del tessuto è stato registrato. Per gli ultimi esperimenti (validazione istologica e valutazione micro-CT), 8 premolari mandibolari estratti con polpa precedentemente vitale sono stati immersi in formalina tamponata, scansionati in un dispositivo micro-CT, accessi, immersi in Lugol per 7 giorni e scansionati nuovamente. Poi, i canali radicolari di 5 denti sono stati preparati e scansionati, e il volume del tessuto pulpare rimanente identificato e quantificato, mentre 3 denti sono stati elaborati istologicamente. Gli stessi campioni sono stati sottoposti a valutazione istologica, e le immagini delle sezioni istologiche sono state registrate con le corrispondenti immagini micro-CT per verificare se il tessuto pulpare nelle sezioni istologiche corrispondesse al suo omologo nei tessuti impregnati di Lugol identificati nelle fette micro-CT.

Risultati: Non c'era alcun effetto discernibile sulla radiopacità quando il NaOCl è stato miscelato con la soluzione di Lugol. Il trattamento dei tessuti non ha influenzato il tempo necessario per la completa dissoluzione della carne bovina fresca. La valutazione istologica ha rivelato una correlazione tra micro-CT e immagini istologiche che confermano l'identificazione del tessuto polpa impregnato di Lugol nelle immagini micro-CT.

Conclusioni: La soluzione di Lugol radiocontrasto non è stata influenzata dal NaOCl e non ha interferito con la sua capacità di dissoluzione dei tessuti molli. Il protocollo di impregnazione utilizzando la soluzione di Lugol ha consentito la visualizzazione del tessuto polpa nelle immagini micro-CT e l'identificazione dei resti di polpa dopo le procedure chimico-meccaniche del canale.

Introduzione

L'analisi convenzionale delle sezioni istologiche e l'uso della tomografia computerizzata a raggi X (micro-CT) sono considerati i metodi standard d'oro per valutare le procedure di pulizia e modellatura durante la preparazione del canale radicolare. Mentre il micro-CT consente di identificare e quantificare i tessuti mineralizzati del canale radicolare rimossi dalla preparazione meccanica, la quantità di tessuto polpa rimanente (non mineralizzato) è solitamente valutata su sezioni istologiche. Pertanto, nonostante l'utilità della tecnologia micro-CT, questo metodo è stato limitato alla valutazione delle modifiche lungo le pareti del canale, inclusi il trasporto e la creazione di aberrazioni, come zip e perforazioni. A causa del potere penetrante dei raggi X, le tecniche micro-CT forniscono una mappa di densità 3D di campioni e tessuti che assorbono fortemente questa radiazione (Alfaro et al. 2015, Cunha et al. 2015). Tuttavia, non è adatta per l'imaging dei tessuti molli, come la polpa dentale, poiché questi tessuti assorbono i raggi X in misura molto limitata (Gignac & Kley 2014).

Recentemente, è stato impiegato un approccio correlativo utilizzando l'istologia come metodo complementare per la valutazione della micro-CT in due studi per valutare vari protocolli chemomeccanici nei canali radicolari (Lacerda et al. 2017, Siqueira et al. 2018). Entrambi gli studi hanno dimostrato istologicamente la presenza di resti di tessuto pulpare attaccati alle pareti del canale non toccate precedentemente identificate dall'analisi micro-CT. Sebbene questo approccio correlativo utilizzando metodi diversi possa consentire l'assegnazione di meccanismi di causalità, l'analisi istologica di solito consente di valutare solo poche sezioni per radice, il che fornisce dati molto limitati ed è incoerente con la quantità di informazioni in centinaia di immagini sezionali solitamente prodotte dalla scansione micro-CT di un tipico canale radicolare. Inoltre, il sezionamento istologico è una procedura dispendiosa in termini di tempo e costosa che distrugge il campione.

È ovviamente auspicabile sviluppare un metodo sperimentale affidabile e non distruttivo in grado di valutare simultaneamente la qualità e la quantità di tessuti molli e duri in un campione eterogeneo come il dente umano. In altre aree di ricerca, questa limitazione è stata superata utilizzando vari agenti di contrasto come osmio, oro, solfato di bario e coloranti a base di iodio (Metscher 2009a, b, Faulwetter et al. 2013, Pauwels et al. 2013). In generale, è stato dimostrato che una soluzione acquosa di iodio di Lugol, chiamata anche ioduro di potassio iodio (I₂KI), è uno dei mezzi più efficaci per differenziare rapidamente una varietà di tipi di tessuti molli. La soluzione di Lugol è un'opzione di colorazione semplice, economica, non tossica e rapida per il miglioramento del contrasto dei tessuti molli. Tuttavia, il suo utilizzo è stato limitato a studi anatomici di una vasta gamma di campioni biologici utilizzando una vasta gamma di diverse concentrazioni di iodio e durate di colorazione, a seconda del tipo di tessuto (Heimel et al. 2019). Attualmente, nonostante il fatto che l'impregnazione di Lugol sia l'agente di contrasto più ampiamente utilizzato nello studio anatomico dei tessuti molli, non è ancora chiaro se questa soluzione sarebbe adatta nella valutazione micro-CT del tessuto pulpare dopo il debridement del canale radicolare ex vivo. Uno dei problemi fondamentali quando si utilizza Lugol riguarda l'ipoclorito di sodio (NaOCl), il principale irrigante endodontico utilizzato per dissolvere il tessuto pulpare necrotico (Zehnder 2006), che reagisce con lo iodio (Vogel 1978) e potrebbe quindi interferire con la sua impregnazione e visibilità nelle immagini radiografiche.

La presente comunicazione riporta una serie di esperimenti a cascata volti a introdurre ed esplorare il potenziale di visualizzare il tessuto della polpa dentale su immagini micro-CT utilizzando Lugol come soluzione di contrasto. La cascata di esperimenti mirava a convalidare il protocollo di impregnazione e il metodo di micro-CT con contrasto migliorato (CE-CT) identificando nel contempo i vantaggi e le potenziali limitazioni di questa nuova metodologia. Gli esperimenti a cascata sono stati progettati per:

• Valutare il potenziale del NaOCl di ridurre il grado di contrasto radiografico associato a Lugol (test di radiopacità);
• Verificare la possibilità che la soluzione di Lugol influisca sull'effetto proteolitico del NaOCl (test di dissoluzione dei tessuti molli);
• Valutare la capacità della soluzione di Lugol di impregnare correttamente il tessuto pulpare mediante imaging correlativo di micro-CT migliorato con Lugol e istologia convenzionale (validazione istologica);
• Misurare il volume rimanente di tessuto pulpare impregnato di Lugol (valutazione volumetrica micro-CT).

Materiali e metodi

Impatto del NaOCl sulla radiopacità della soluzione di Lugol

La soluzione di Lugol (I₂KI) utilizzata per tutti gli esperimenti aveva una concentrazione del 5% di I₂ e del 10% di KI. Per valutare l'impatto del NaOCl sulla sua radiopacità, è stata eseguita una serie di diluizioni 1:1 in acqua distillata e NaOCl al 5,25% (1,5 mL di volume totale). La soluzione pura e le sue diluizioni sono state pipettate in piatti trasparenti rotondi in polistirene (Semadeni, Ostermundigen, Svizzera) con un diametro interno di 23,4 mm e una profondità di 3,5 mm. La radiopacità è stata determinata utilizzando un set-up standard come descritto in precedenza (Hertig et al. 2017). In breve, set di dati elettronici sono stati generati utilizzando un'unità fissa (Trophy, Parigi, Francia) a 65 kV, 8 mA e 0,22 s con una distanza fuoco-film di 25 cm e sensori elettronici (Digora; Soredex, Tuusula, Finlandia). Le immagini sono state analizzate utilizzando ImageJ (Bethesda, MD, USA). I valori di grigio sono stati normalizzati in ciascuna immagine rispetto a un gradino di alluminio, con una curva standard individuale per ciascuna immagine. Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. La radiopacità relativa della soluzione di Lugol e delle sue diluizioni è espressa come equivalente di alluminio (in mm) per mm di soluzione.

Test di dissoluzione dei tessuti molli

Trenta fette di carne bovina fresca sono state adattate a un peso simile (2 mg) e dimensioni (4 x 4 mm) utilizzando un bisturi chirurgico n. 15. Dieci fette non sono state sottoposte a nessun trattamento dei tessuti, mentre le altre 20 sono state fissate in formaldeide per 24 ore. Dopo di che, 10 delle fette fissate sono state ulteriormente immerse nella soluzione di Lugol per altre 24 ore. Successivamente, tutti i campioni sono stati posti singolarmente in flask contenenti 40 mL di NaOCl al 5,25% e il tempo totale necessario per la completa dissoluzione del tessuto polpare (in min) è stato registrato. Tutte le procedure di test sono state eseguite a temperatura ambiente. Questa indagine non è stata classificata come uno studio sugli animali perché non ha avuto alcuna influenza sul destino premortale o sul processo di macellazione degli animali. L'analisi preliminare dei dati grezzi ha indicato l'aderenza a una distribuzione gaussiana (test di Shapiro-Wilk, P < 0,05). I dati sono stati confrontati tra i gruppi utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguita dal test HSD di Tukey. L'errore alfa è stato considerato al 5%.

Valutazione micro-CT dei residui di tessuto pulpare

Dopo l'approvazione da parte del comitato etico locale (protocollo n. 12127319.3.0000.5243), otto premolari mandibolari monoradicolati non cariati e un molare mandibolare con polpa vitale, estratti per motivi ortodontici, sono stati immersi in formalina tamponata al 10% e conservati per un massimo di 30 giorni a 15 °C. Successivamente, i denti sono stati scansionati a una dimensione di pixel di 14,37 lm utilizzando un dispositivo micro-CT (SkyScan 1173; Bruker microCT, Kontich, Belgio) impostato a 70 kV, 114 mA, rotazione a 360° attorno all'asse verticale con un passo di rotazione di 0,5°, media dei fotogrammi di 5, utilizzando un filtro in alluminio spesso 1,0 mm. Il software NRecon v.1.7.16 (Bruker micro-CT) è stato utilizzato per ricostruire le proiezioni micro-CT in sezioni trasversali assiali utilizzando una correzione dell'artefatto ad anello di 4, limiti di contrasto che vanno da 0,006 a 0,05 e correzione dell'indurimento del fascio del 40%, risultando in 800–900 immagini in scala di grigi per dente dal giunto cemento-smalto all'apice. Per verificare la morfologia del canale, le immagini sezionali sono state segmentate utilizzando una routine automatica (De-Deus et al. 2020) nel software FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Madison, WI, USA), e il rapporto di aspetto del canale radicolare, definito come il rapporto tra i diametri maggiore e minore, è stato misurato in ciascuna sezione dall'orifizio al forame apicale. Successivamente, il volume del canale (in mm³) è stato calcolato come il volume del canale radicolare binarizzato all'interno del volume di interesse.

Dopo la preparazione convenzionale della cavità d'accesso, ogni dente è stato immerso nella soluzione di Lugol per 7 giorni e sottoposto a una nuova scansione e procedure di ricostruzione utilizzando i parametri precedentemente menzionati al fine di valutare l'impregnazione dell'intero tessuto pulpare da parte della soluzione di contrasto. Questo insieme di immagini è stato coregistrato con il set di dati non colorato utilizzando l'algoritmo affine implementato nel software 3D Slicer 4.6.0 (http://www.slicer.org) (Fedorov et al. 2012), e la dentina radicolare del dente dopo l'immersione è stata rimossa tramite un'operazione booleana per ridurre il rumore generato dalla segmentazione del tessuto pulpare. Così, il tessuto pulpare impregnato con la soluzione di Lugol è stato osservato e quantificato (in mm³) tramite il processo di segmentazione con un valore di soglia specifico, utilizzando lo strumento Object Counter disponibile nel software FIJI/ImageJ. Dopo di che, i canali radicolari di 5 dei 8 premolari selezionati sono stati preparati chimico-meccanicamente, mentre gli altri 4 denti sani (3 premolari e 1 molare) sono stati preparati per il sezionamento istologico per confermare la presenza dei resti di tessuto pulpare (gruppo di controllo).

Preparazione del canale radicolare

I canali radicolari sono stati preparati fino alla lunghezza di lavoro con lo strumento Reciproc R25 (VDW GmbH, Monaco, Germania) azionato da un motore VDW Silver (VDW GmbH) nel programma preimpostato ‘RECIPROC ALL’ utilizzando una leggera pressione apicale con un movimento lento di picchiettamento in entrata e uscita di ampiezza di 3 mm. Dopo aver completato tre movimenti di picchiettamento, lo strumento è stato rimosso dal canale e le sue flutes pulite inserendolo in una spugna inumidita con alcol. La lunghezza di lavoro è stata raggiunta dopo 3 onde di strumentazione. La patenza apicale è stata eseguita con un K-file di dimensione 15 (Dentsply Sirona Endodontics, Ballaigues, Svizzera) durante le procedure di preparazione. L'irrigazione è stata eseguita con un totale di 12 mL di NaOCl al 5,25% somministrato nel canale radicolare con un ago a doppio lato NaviTip da 31-G (Ultradent Inc., South Jordan, UT, USA) portato fino a 1 mm prima della lunghezza di lavoro durante le procedure di preparazione. Dopo la preparazione del canale radicolare, i campioni sono stati riesaminati, ricostruiti e coregistrati utilizzando i parametri sopra menzionati. Successivamente, è stato calcolato il volume dei resti di tessuto pulpare impregnati con la soluzione di Lugol (in mm³) e quantificato come valore percentuale basato sul volume iniziale del tessuto pulpare.

Valutazione istologica

Dopo le procedure sperimentali descritte sopra, i campioni sono stati demineralizzati in una soluzione di acido formico al 22,5% (vol/vol) più citrato di sodio al 10% (wt/vol) per un periodo di 2–3 settimane. Il punto finale è stato monitorato radiograficamente. I campioni sono stati quindi risciacquati per 24 ore in acqua del rubinetto, disidratati e trattati per l'esame istologico di routine. I denti sono stati incorporati in blocchi di paraffina e sono state ottenute sezioni trasversali spesse 0,6 µm ogni 1 mm dalla giunzione cemento-smalto all'apice, risultando in 8 fette per dente. Le sezioni acquisite sono state montate su lastre di vetro e colorate con ematossilina-eosina. Le immagini istologiche sono state visualizzate utilizzando un microscopio a luce completamente motorizzato Axioplan 2 Imaging (Carl Zeiss Vision, Hallbergmoos, Germania).

Abbinamento delle immagini micro-CT impregnate di Lugol e delle fette istologiche

Le fette micro-CT acquisite contenenti il tessuto pulpare impregnato di Lugol sono state ispezionate lungo l'asse z utilizzando un sistema di coordinate di riferimento basato su un algoritmo di registrazione basato su punti di riferimento (software Analyze; Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) per allinearle con le immagini micro-radiografiche delle sezioni istologiche. Dopo aver selezionato le immagini corrispondenti, è stato eseguito un aggiustamento di standardizzazione dimensionale che includeva ingrandimento automatico, ridimensionamento e ritaglio, mediante una procedura assistita da computer. Questo passaggio procedurale ha permesso agli esaminatori di ispezionare in modo affidabile le radici agli stessi livelli e quindi, verificare qualitativamente se il tessuto pulpare nella sezione istologica corrispondeva al suo omologo nella fetta micro-CT impregnato di Lugol, confermando l'efficacia del protocollo di impregnazione e dei parametri di scansione. Due esaminatori precalibrati hanno utilizzato un proforma con criteri predefiniti per analizzare il grado di corrispondenza tra le immagini impregnate di Lugol e quelle istologiche. La procedura di analisi delle immagini è stata eseguita su un monitor computer di alta qualità da 34’ con la possibilità di ingrandire le immagini (fino a 109) e invertire la modalità colore. Per convalidare il processo analitico, le analisi sono state ripetute due volte a intervalli di 10 giorni per valutare la riproducibilità.

Risultati

Impatto del NaOCl sulla radiopacità della soluzione di Lugol

La soluzione di Lugol pura aveva una radiopacità di 0.70 ± 0.09 mm Al mm^—1. La diluizione in NaOCl al 5.25% ha avuto un effetto simile sulla radiopacità rispetto alla procedura di controllo in acqua, con le diluizioni più elevate in NaOCl che mostrano una radiopacità leggermente superiore (Fig. 1), basata sulla differenza di radiopacità tra la soluzione di NaOCl al 5.25% pura e l'acqua di 0.05 mm Al mm^—1. Non c'è stato alcun effetto discernibile sulla radiopacità causato dall'interazione chimica tra il NaOCl e la soluzione di Lugol, che era visibile attraverso l'illuminazione del colore marrone in presenza di NaOCl.

Test di dissoluzione dei tessuti molli

I grafici a violino illustrano i valori medi, minimi e massimi, così come la distribuzione dei dati della dissoluzione dei tessuti tra i campioni (Fig. 2). Il trattamento dei tessuti in formaldeide e nella soluzione di Lugol non ha influenzato il tempo necessario per la dissoluzione della carne bovina fresca (P > 0.05).

Validazione istologica

La qualità complessiva del protocollo di colorazione utilizzato è illustrata nella Figura 3. L'analisi correlativa tra micro-CT e immagini istologiche ha confermato l'identità del tessuto pulpare impregnato di Lugol nelle immagini micro-CT. I risultati delle immagini micro-CT e istologiche abbinate sono mostrati nelle Figure 4 e 5, confermando la qualità del protocollo di colorazione.

Valutazione volumetrica micro-CT

Inoltre, i resti di polpa segmentati dopo la preparazione del canale radicolare sono stati quantificati ed espressi come valore percentuale. Il volume del canale radicolare strumentato e le aree del canale non strumentato acquisite mediante il metodo micro-CT sono state anch'esse quantificate (Tabella 1) e illustrate nelle Figure 6 e 7 e nel Video Supplementare 1. Il volume del canale radicolare e il rapporto di aspetto hanno influenzato direttamente la rimozione del tessuto pulpare durante la strumentazione. I denti con valori di rapporto di aspetto inferiori a 3,5, espressi dalla curva grafica e da alti volumi, erano associati a volumi minori di resti di tessuto pulpare.

Discussione

Questa comunicazione introduce un nuovo metodo di colorazione per il tessuto della polpa dentale nel contesto della valutazione micro-CT della rimozione dei detriti del canale radicolare con evidenti usi benefici per future ricerche in questo campo. Il metodo non distruttivo proposto è in grado di fornire immagini ad alta risoluzione e informazioni 3D sul tessuto pulpare e sulla dentina simultaneamente, consentendo così la valutazione longitudinale e quantitativa volumetrica delle procedure di pulizia e modellatura del canale radicolare. Da quando Gysi & Röse (1894) pubblicarono i primi fotomicrografi di alta qualità che rappresentavano i dettagli degli elementi vascolari, linfatici e nervosi del complesso polpa-dentina di un molare mandibolare, e Kölliker (1852) fornì la prima descrizione della polpa dentale, da lui chiamata Pulpa dentis, nel suo classico libro sulle minute strutture dei tessuti e degli organi del corpo, molti studi hanno indagato i denti utilizzando metodi istologici. Utilizzando questa tecnica, Hatton et al. (1928) furono i primi a dimostrare che il canale era stato solo superficialmente pulito e che gran parte del tessuto pulpare non era stata rimossa dopo la preparazione con strumenti in acciaio inossidabile. Tuttavia, solo dopo che Walton (1976) pubblicò uno studio fondamentale che valutava la quantità di tessuto pulpare rimanente dopo le procedure di pulizia e modellatura, il sezionamento istologico basato su paraffina divenne il metodo standard per determinare l'efficacia delle procedure di rimozione dei detriti all'interno dello spazio del canale radicolare.

Nei denti intatti con polpa vitale, normalmente utilizzati come controllo negli studi di sezionamento istologico, il tessuto pulpale è attaccato all'intero perimetro del canale radicolare (De-Deus et al. 2010, 2011), mentre i resti di tessuto nei gruppi sperimentali confermano quali aree lungo le pareti del canale non sono state debride meccanicamente o dove i protocolli di irrigazione sono stati inefficaci. Poiché i resti di polpa possono servire da substrato per i batteri e potrebbero influenzare negativamente la qualità delle procedure di riempimento del canale (Ricucci et al. 2009, Ricucci & Siqueira 2011), questo avvalora teoricamente questa variabile sperimentale, il tessuto pulpale rimanente, come un punto finale surrogato accettato per la qualità delle procedure di debridement all'interno dello spazio del canale radicolare. Tuttavia, i processi e il carico di lavoro risultante per la preparazione dei campioni che abbraccia sezionamento, colorazione, imaging e la valutazione istologica finale rimangono una tecnica ingombrante e laboriosa. Specificamente, nel contesto della ricerca di laboratorio endodontica, la decalcificazione dei tessuti dentali mineralizzati è un passaggio che richiede tempo e complicato ed è difficile ottenere campioni di alta qualità senza danneggiare il tessuto pulpale. Questo diventa ancora più importante poiché, in generale, il sezionamento istologico dei tessuti duri decalcificati è soggetto a indurre notevoli distorsioni tissutali, problemi di lavorazione e artefatti strutturali. Ad esempio, il ritiro del tessuto fino al 3% si verifica con i tessuti ossei (Lane & Ráliš 1983, Henson et al. 1994), mentre la disidratazione del tessuto molle può creare un ritiro fino all'11% (Rown et al. 2002). Pertanto, anche con le utili informazioni disponibili in letteratura su questo argomento, è importante notare che i dati di microscopia quantitativa derivati dal sezionamento istologico provengono da tessuti che presumibilmente si sono ristretti durante la preparazione del campione. Inoltre, le tecniche di sezionamento istologico portano invariabilmente alla perdita di campioni, rendendo impossibili esperimenti longitudinali nel tempo. Pertanto, l'istologia può essere considerata un metodo arcaico rispetto all'approccio volumetrico e quantitativo ottenuto mediante metodi di imaging non distruttivi (Tabella 2), anche se ad oggi rimane l'unico modello sperimentale disponibile che consente la valutazione simultanea sia dei tessuti duri mineralizzati che di quelli molli dei denti a livello ultrastrutturale e, di conseguenza, è in grado di fare luce su quest'area di ricerca importante (De-Deus et al. 2008, 2010, 2011).

Numerosi studi che utilizzano la tecnologia micro-CT non distruttiva hanno dimostrato che la preparazione delle pareti dei canali radicolari mediante strumenti endodontici attivati in movimento rotatorio o reciprocante non è ideale (Paqué et al. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani et al. 2013, De-Deus et al. 2015, Zuolo et al. 2018). La preparazione meccanica con questi strumenti è limitata poiché tendono a preparare solo gli aspetti centrali dei canali radicolari per creare una forma rotonda, lasciando intatte la maggior parte delle estensioni buccali e linguali di questi spazi complessi, anche quando si tentano movimenti laterali come quando si utilizza un movimento di spazzolamento (Paqué et al. 2010, Paqué & Peters 2011, Versiani et al. 2013, De-Deus et al. 2015, Zuolo et al. 2018). Sebbene la micro-CT possa fornire misurazioni preziose e accurate riguardo alla posizione e alla quantità di dentina rimossa durante la preparazione del canale, non fornisce informazioni sui tessuti pulpari o sui biofilm microbici che possono rimanere attaccati alle pareti del canale radicolare, in particolare in aree non raggiunte dall'azione meccanica degli strumenti, come istmi, pinne, anastomosi e canali accessori (Versiani et al. 2013). Ciò significa che la micro-CT è stata essenzialmente limitata alla valutazione delle modifiche alle pareti dentinali poiché, nella sua essenza, la micro-CT non è adatta a immagini di tessuti molli poiché sono praticamente 'trasparenti' ai raggi X. Questa limitazione è correlata all'incapacità di questo metodo radiografico derivato dalla ricerca ossea, progettato per rappresentare elementi più densi come il calcio, di rilevare tessuti molli non radiolucenti (Rüegsegger et al. 1996). Tuttavia, ci sono stati progressi significativi nella ricerca basata su micro-CT in altri ambiti biomedici, inclusi diversi tipi di scanner da banco, acquisizione di informazioni a contrasto di fase, protocolli di acquisizione di scansione più rapidi ed efficaci e algoritmi di ricostruzione. Presi insieme, tali sviluppi possono essere sfruttati per immagini di tessuti molli (non calcificati) superando la sua limitazione intrinseca. A tal fine, è possibile ottenere un miglioramento della visualizzazione dei tessuti molli utilizzando agenti di contrasto radio-opachi per ottenere attenuazione ai raggi X, la cosiddetta tecnica di micro-CT a contrasto migliorato (CE-CT). In breve, la CE-CT è adatta per valutare tessuti eterogenei come i denti.

Gli agenti di contrasto sono composti da specifici agenti chimici con un alto peso molecolare in grado di legarsi naturalmente ai tessuti molli per creare un 'contrasto' in modo efficace. L'agente di contrasto utilizzato nello studio attuale è stato lo iodio inorganico di Lugol (I₂KI), che è stato introdotto per la prima volta da Metscher (2009a), il quale ha testato diversi protocolli di fissazione dei campioni e il potenziale di colorazione di diversi composti commercialmente accessibili per vari tipi di tessuti molli. Ad oggi, è stato dimostrato che lo iodio di Lugol ha un'alta affinità per il glicogeno (Fennerty 1999) e colpisce le cellule epiteliali e i tessuti molli dei topi (Degenhardt et al. 2010, Baverstock et al. 2013). Pertanto, il potenziale dello iodio di Lugol per ottenere immagini del tessuto pulpare con micro-CT è stato testato nello studio attuale. Attraverso una serie di prove con vari protocolli di impregnazione, denti con cavità di accesso convenzionali immersi nella soluzione di Lugol per 7 giorni hanno consentito l'efficace impregnazione del tessuto pulpare (Figure 3 e 7). Tuttavia, due aspetti riguardanti l'uso del metodo CE-CT per analizzare i resti pulpari longitudinalmente dopo l'irrigazione del canale radicolare con soluzione di NaOCl potrebbero essere motivo di preoccupazione. Il primo aspetto riguarda la reazione chimica del NaOCl con lo iodio della soluzione di Lugol. Nonostante questa interazione, la soluzione di Lugol non ha ridotto significativamente la capacità proteolitica del NaOCl nelle condizioni attuali. La seconda preoccupazione era il potenziale del NaOCl di ridurre il grado di contrasto associato al tessuto pulpare impregnato di Lugol. Il test di radiopacità ha rivelato che la soluzione di Lugol era adatta per impregnare il tessuto pulpare poiché il NaOCl non interferiva con la sua radiopacità. Presi insieme, questi risultati hanno confermato che la soluzione di Lugol può essere utilizzata come agente di contrasto per testare il tessuto pulpare come substrato per l'analisi dei protocolli di irrigazione a base di NaOCl. Un'ulteriore analisi si è concentrata sulla validazione della soluzione di Lugol nell'identificare correttamente il tessuto pulpare. A tal fine, è stata utilizzata la sezionatura istologica a base di paraffina per confermare se il tessuto pulpare impregnato con la soluzione di Lugol fosse visibile sulle scansioni micro-CT. È stato quindi sviluppato un approccio sperimentale per confrontare le sezioni istologiche con le loro immagini corrispondenti acquisite dagli stack micro-CT, superando i tipici problemi di allineamento in questo tipo di analisi correlativa. I risultati hanno confermato la corretta identificazione del tessuto pulpare nelle immagini micro-CT impregnate di Lugol e hanno quindi dimostrato la qualità del protocollo di impregnazione (Figure 4 e 5).

È importante notare che, in particolare per la ricerca endodontica che utilizza il tessuto pulpare residuo come parametro di esito, l'approccio CE-CT ha il chiaro vantaggio di non concentrarsi su una valutazione ultrastrutturale dettagliata del tessuto molle. Invece, il CE-CT consente facilmente una valutazione quantitativa del tessuto pulpare residuo nel suo insieme in esperimenti longitudinali (nel tempo) (Figure 6 e 7). Da un punto di vista qualitativo, centinaia di sezioni trasversali prodotte per dente dal CE-CT possono fornire una migliore comprensione della stretta relazione tra l'anatomia interna dei canali radicolari e i protocolli di modellamento meccanico e irrigazione. Questo perché il CE-CT fornisce modelli 3D ad alta risoluzione, che contengono informazioni veritiere sulle dimensioni, la quantificazione strutturale e le caratteristiche anatomiche dei tessuti eterogenei, ad esempio dentina e tessuto pulpare. Allo stesso tempo, questo metodo consente la valutazione della distribuzione preoperatoria del tessuto pulpare nello spazio canalare prima delle procedure sperimentali anche dopo 7 giorni senza alcun protocollo di fissazione. Questo è un punto importante poiché la quantità e la posizione del tessuto pulpare possono agire come un fattore di confondimento, influenzando l'esito dell'esperimento. In questo modo, l'uso del metodo CE-CT in denti con polpa vitale sembra essere valido e riproducibile, poiché il tessuto pulpare era distribuito lungo l'intero sistema del canale radicolare in tutti i denti sani. Studi futuri che utilizzano questo metodo innovativo dovrebbero includere il confronto di diverse soluzioni irriganti (soluzioni inerti vs attive) nel tempo e protocolli di preparazione sull'efficienza di dissoluzione/rimozione del tessuto pulpare dai sistemi del canale radicolare. Ulteriori miglioramenti su questo metodo consentirebbero anche di applicarlo nella ricerca in vivo utilizzando il CBCT, per esempio. Al momento, la metodologia attuale richiede che il mezzo di contrasto sia a contatto con il tessuto pulpare per almeno 7 giorni e, in un approccio in vivo, richiederebbe anche imaging tomografico pre- e post-operatorio, che deve chiaramente rispettare principi etici di ricerca accettabili. Definitivamente, il protocollo attuale dovrebbe essere convalidato in vivo utilizzando il CBCT. D'altra parte, può essere applicato in sicurezza in vivo utilizzando denti non cariati e non restaurati con polpe vitali programmati per estrazione senza scansioni pre- o post-operatorie. Ad esempio, dopo aver confermato la condizione vitale della polpa mediante test convenzionali, il protocollo chemomeccanico può essere applicato in situ e la soluzione di contrasto iniettata nello spazio del canale pulpare e la cavità di accesso coronale ripristinata per garantire che la soluzione di Lugol rimanga all'interno dello spazio del canale radicolare. Quindi, il dente può essere estratto, conservato e valutato tramite imaging micro-CT dopo una settimana.

In sintesi, lo studio attuale si concentra quindi sulla fornitura di prove preliminari ma originali a sostegno di studi longitudinali CE-CT non distruttivi utilizzando il tessuto pulpare residuo come parametro di risultato. È stato dimostrato che il CE-CT combina, in un unico metodo, i principali vantaggi della tecnologia di imaging micro-CT (valutazione del tessuto mineralizzato) e dei metodi istologici tradizionali (valutazione del tessuto non mineralizzato) per studiare le procedure di detersione dei canali radicolari abbracciando la possibilità di valutare, identificare e misurare quelle aree del canale non influenzate né dalla preparazione meccanica né dai protocolli di irrigazione. È degno di nota il fatto che il CE-CT consente di studiare indipendentemente la preparazione meccanica del canale e i protocolli di irrigazione o l'effetto sinergico combinato delle procedure chimico-meccaniche.

Conclusioni

La soluzione di Lugol ha permesso la visualizzazione del tessuto pulpare nelle immagini micro-CT. La soluzione di Lugol non è stata influenzata dal NaOCl nella sua radiopacità e non ha interferito con la dissoluzione dei tessuti molli fissi e colorati. In termini pratici, la tecnica di imaging micro-CT con contrasto migliorato con la soluzione di Lugol presentata qui consente di valutare indipendentemente o insieme l'effetto della dissoluzione chimica e la rimozione meccanica del tessuto pulpare attraverso procedure di pulizia e modellazione, rendendola una tecnica molto utile nella ricerca endodontica basata in laboratorio.

Autori: G. De-Deus, F. G. Belladonna, D. M. Cavalcante, M. Simões-Carvalho, E. J. N. L. Silva, J. C. A. Carvalhal, R. Q. Zamolyi, R. T. Lopes, M. A. Versiani, P. M. H. Dummer, M. Zehnder

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