L'uso del trattamento superficiale al plasma a vuoto per migliorare l'idrofilia e la bagnabilità dei sostituti ossei e delle membrane riassorbibili: uno studio in vitro

Abstract

Background/Objectives: Volevamo valutare in vitro se il trattamento superficiale al plasma in vuoto di sostituti ossei e membrane riassorbibili potesse migliorare l'idrofilicità e la bagnabilità dei materiali testati.

Methods: Un totale di 28 campioni sterilizzati sono stati considerati per questa ricerca e suddivisi in tre gruppi. Sei campioni sono stati utilizzati per l'analisi SEM-EDS. Gli altri 22 campioni sono stati assegnati casualmente ai gruppi di test (trattati al plasma, n = 11) e di controllo (nessun trattamento, n = 11). Il trattamento superficiale al plasma in vuoto è stato eseguito nel gruppo di test prima dell'analisi SEM-EDS utilizzando l'ACTILINK reborn con un supporto per materiali (Plasmapp Co., Ltd., Daejeon, Repubblica di Corea). Gli inchiostri Plasmatreat (Plasmatreat, Steinhagen, Germania) sono stati utilizzati per valutare le differenze nell'idrofilicità tra i gruppi di test e di controllo. Le misure di risultato erano il tempo di assorbimento, il grado di bagnabilità e il grado di decontaminazione dopo diversi cicli di tempo.

Risultati: Dopo il trattamento superficiale al plasma a vuoto, il tempo di assorbimento delle inchiostri è diminuito statisticamente in tutti i sottogruppi (p < 0.05), mentre il grado di bagnabilità è aumentato. Le analisi SEM-EDS hanno mostrato un aumento del tasso di riduzione delle impurità di carbonio dopo fino a tre cicli di trattamento superficiale al plasma a vuoto. Inoltre, l'analisi SEM-EDS non ha rivelato aree di danno causate dai trattamenti multipli.

Conclusioni: All'interno delle limitazioni di questo studio in vitro, il trattamento superficiale al plasma a vuoto ha aumentato l'idrofilicità e la bagnabilità dei biomateriali testati. Il innesto osseo in particelle e i blocchi ossei dovrebbero essere trattati utilizzando programmi di tempo più lunghi. Sono necessari ulteriori studi clinici randomizzati ben condotti con calcoli della dimensione del campione per confermare questi risultati preliminari.

Introduzione

L'implantologia orale è riconosciuta come una metodologia clinica sicura e prevedibile in grado di garantire risultati a lungo termine nel campo della riabilitazione orale. L'osseointegrazione degli impianti dentali ha le sue origini nei primi anni '50, quando il Prof. Per-Ingvar Brånemark, un chirurgo ortopedico svedese, eseguì esperimenti ortopedici sulle gambe dei conigli. Attualmente, un impianto è considerato osseointegrato quando non c'è progressione

movimento relativo tra l'impianto e l'osso con cui dovrebbe avere contatto diretto. In passato, uno degli aspetti più importanti per raggiungere l'osseointegrazione era la stabilità primaria durante il posizionamento dell'impianto. Dalle sue origini ad oggi, la letteratura si è concentrata su principi puramente orientati biologicamente. In relazione a quest'ultimo, sono stati investigati e implementati numerosi metodi di trattamento della superficie per migliorare le caratteristiche biologiche della superficie degli impianti, inclusi i miglioramenti della rugosità della superficie dell'impianto e dell'idrofilicità all'interno del processo di osseointegrazione. Secondo studi recenti, entrambi i trattamenti sembrano migliorare il meccanismo di osseointegrazione, con una formazione ossea più forte e rapida, consentendo un'osseointegrazione più veloce e risultati a lungo termine di successo.

Numerosi studi hanno valutato il trattamento della superficie degli impianti dentali e dei monconi. L'attivazione della superficie di un impianto in titanio attraverso il trattamento al plasma potrebbe rappresentare una strategia positiva per rimuovere contaminanti dai monconi dentali e minimizzare la riassorbimento osseo peri-impiantare, oltre ad aumentare le percentuali di nuovo osso in stretto contatto con la superficie dell'impianto. Questo fenomeno è stato dimostrato essere mediato in vitro dall'aumento dell'adsorbimento delle proteine e dell'adesione degli osteoblasti sulla superficie di titanio. Tuttavia, per quanto a conoscenza degli autori e al momento della scrittura, nessuna ricerca ha ancora valutato trattamenti in grado di aumentare l'energia superficiale dei sostituti ossei e delle membrane. In uno studio animale, Ho Jik Yang et al. hanno valutato l'effetto del trattamento della superficie al plasma in vuoto su una matrice dermica acellulare umana, evidenziando il potenziale effetto del trattamento sul miglioramento dei risultati della chirurgia ricostruttiva. Il trattamento della superficie al plasma in vuoto ha anche dimostrato un miglioramento nell'adesione cellulare, modificando la bagnabilità della superficie della piastra di titanio, con una riduzione dell'angolo di contatto tra i fluidi biologici e la superficie dell'impianto che favorisce la diffusione delle cellule osteoblastiche e non lascia residui dopo il trattamento. Sono stati riportati alcuni cambiamenti nelle caratteristiche fisico-chimiche, come l'energia libera superficiale, il contenuto di idrocarburi e i gruppi idrossilici funzionali, che potrebbero influenzare potenzialmente la risposta infiammatoria nel tessuto peri-impiantare. In uno studio clinico controllato randomizzato, il trattamento al plasma di argon ha dimostrato una riduzione del rimodellamento osseo peri-impiantare, con risultati statisticamente più forti fino a 5 anni di follow-up.

Lo scopo principale di questo studio in vitro era valutare se il trattamento superficiale al plasma in vuoto di sostituti ossei e membrane riassorbibili, comunemente utilizzati per la preservazione dell'alveolo e le procedure GBR, potesse migliorare l'energia superficiale (idrofilicità) e la bagnabilità dei materiali testati. L'ipotesi nulla era che il trattamento superficiale al plasma in vuoto non avesse alcun effetto sul tempo di assorbimento o sulla bagnabilità. Un obiettivo secondario era valutare, utilizzando analisi SEM-EDS, il grado di decontaminazione dopo diversi cicli di tempo. Questo studio è stato riportato secondo le linee guida CRIS (Checklist for Reporting In-vitro Studies).

Materiali e Metodi

2.1 Campioni

Un totale di 28 campioni sterilizzati sono stati considerati in questa ricerca randomizzata in vitro (test e controllo). Non è stata effettuata alcuna calcolo della dimensione del campione poiché non ci sono altri studi nella letteratura scientifica che abbiano confrontato biomateriali con e senza trattamento superficiale al plasma in vuoto. È stato utilizzato il numero massimo di campioni in base alla disponibilità del dipartimento. I campioni includevano diversi biomateriali comunemente utilizzati durante la preservazione dell'alveolo e/o le procedure GBR e sono riportati come segue:

• Quattordici blocchi RE-BONE di 10 × 10 × 10 (8) e 10 × 10 × 20 (6) mm (UBGEN SRL, Vigonza, Italia);
• Quattro membrane pericardiche HEART (Bioteck SPA, Arcugnano, Italia);
• Due granuli cancellosi, 0.5 g~1 cc, 0.25–1 mm, OSTEOXENON (Bioteck SPA, Italia);
• Quattro granuli cancellosi, 0.5 g, 0.25–1 mm (non-collagene), BIO-GEN (Bioteck SPA, Italia);
• Quattro Xeno-matrici di collagene XC (Bioteck SPA).

Un totale di 6 su 28 campioni (blocchi RE-BONE [UBGEN SRL, Vigonza, Italia]) sono stati utilizzati per l'analisi SEM-EDS. Gli altri 22 campioni sono stati divisi casualmente in due gruppi uguali di 11 campioni (test, trattati al plasma, e controllo, senza trattamento) e testati per valutare i tempi di assorbimento e i gradi di bagnabilità. Tutte le misurazioni sono state effettuate presso il Dipartimento di Medicina, Chirurgia e Farmacia, Università di Sassari, Italia. L'analisi SEM-EDS di tre dei blocchi RE-BONE trattati al plasma (UBGEN SRL) è stata effettuata presso il Centro R&D Plasmapp (Plasmapp Co, Repubblica di Corea).

L'ACTILINK rinato con un supporto per materiali (Plasmapp Co., Ltd., Daejeon, Repubblica di Corea) è stato utilizzato per trattare i campioni. Inchiostri Plasmatreat (Plasmatreat, Steinhagen, Germania) con diverse tensioni superficiali sono stati utilizzati. L'energia superficiale di diversi biomateriali sterili con (test) e senza (controllo) trattamento superficiale al plasma in vuoto è stata valutata misurando l'angolo di contatto (per valutare la bagnabilità) e il tempo di assorbimento (per valutare l'idrofilicità) degli inchiostri utilizzati.

2.2 Trattamento Superficiale al Plasma in Vuoto

Nel gruppo di test, il trattamento superficiale al plasma in vuoto è stato eseguito utilizzando la macchina ACTILINK rinato (Figura 1) con un supporto personalizzato (un supporto a vortice), progettato per un uso facile. Secondo il protocollo dei produttori, il tempo di ciclo del trattamento superficiale al plasma in vuoto, denominato modalità VORTEX PLASMA, era di 30 s. Tutti i biomateriali nel gruppo di test hanno subito lo stesso tempo di ciclo di trattamento superficiale al plasma in vuoto. Al contrario, nessuno dei biomateriali nel gruppo di controllo ha ricevuto alcun tipo di trattamento. Nel gruppo di test, dopo aver aperto la scatola sterile, il biomateriale testato è stato preso con una pinzetta sterile e inserito nel supporto a vortice sterile, e infine, è stato posizionato nella macchina ACTILINK per il trattamento superficiale al plasma in vuoto. Una volta terminato il trattamento, sia i biomateriali trattati che quelli non trattati sono stati inseriti utilizzando una pinzetta sterile nel supporto sterilizzato, e cinque gocce degli inchiostri Plasmatreat, con due diverse tensioni superficiali (56 e 72 mN/m), sono state lasciate cadere su ciascun campione. Immediatamente dopo, il rispettivo tempo di assorbimento e il grado di bagnabilità sono stati registrati, fotografati e confrontati criticamente per valutare l'idrofilicità e l'angolo di contatto tra l'inchiostro e la superficie dei biomateriali utilizzati. Sono state utilizzate tensioni superficiali di 56 e 72 mN/m perché il valore di 56 mN/m era il più vicino a quello del sangue umano.

2.3 Analisi SEM

Al fine di valutare l'effetto del tempo di trattamento al plasma in vuoto sulla decontaminazione (riduzione delle impurità di carbonio) della superficie di un blocco osseo, sono stati analizzati tre blocchi RE-BONE (UBGEN SRL) utilizzando il sistema SEM-EDS dopo fino a tre cicli di trattamento superficiale al plasma in vuoto. Sei blocchi RE-BONE di 10 × 10 × 20 mm (UBGEN SRL) sono stati utilizzati per l'esame SEM-EDS. Due blocchi RE-BONE (UBGEN SRL) sono stati trattati sotto tre cicli diversi ciascuno ([A] 30 s, [B] 60 s e [C] 90 s) prima del trattamento superficiale al plasma in vuoto. La macchina ACTILINK rinata è stata utilizzata con la modalità VORTEX PLASMA. Dopo ogni ciclo di trattamento, i blocchi ossei sono stati analizzati sotto un microscopio elettronico a scansione (SEM, Thermo Fisher Scientific, Phenom XL, Waltham, MA, USA) collegato a uno spettroscopio a raggi X a dispersione di energia (EDS) per consentire un'analisi mirata delle superfici dei campioni.

2.4 Misure di Risultato

Il tempo di assorbimento e il grado di bagnabilità sono stati valutati da video registrati durante le procedure (Blackmagic Design Pocket Cinema Camera 4K, Blackmagic, Fremont, CA, USA). I gruppi di test e di controllo sono stati testati in confronto nello stesso momento. Due ricercatori hanno eseguito tutti i test (M.T. e M.T).

• Il tempo di assorbimento è stato definito come l'intervallo, in secondi, dal momento in cui l'ultima goccia ha toccato la superficie del biomateriale al momento in cui tutte le gocce di inchiostro erano state assorbite nel biomateriale. Il video registrato è stato valutato utilizzando un'applicazione di editing video (iMovie per MacOS), e il tempo di assorbimento è stato misurato utilizzando la timeline espansa. Tutte le misurazioni sono state ripetute tre volte da due operatori diversi (M.T. e M.T.). È stato calcolato il valore medio e la deviazione standard (SD).
• La bagnabilità (generalmente riferita come idrofilicità) è stata definita come la diffusione delle gocce di inchiostro sulle superfici dei biomateriali, misurata dalla planarità di una goccia sulla superficie solida. I quattro gradi di bagnabilità sono stati definiti come segue:

Grado nullo: Le gocce d'inchiostro sono rimaste nella stessa posizione in cui sono state lasciate con un angolo di contatto di 180°; Grado basso: Quando la macchia d'inchiostro si è leggermente allargata sulla superficie, con un angolo di contatto > 90°; Grado medio: Quando l'espansione moderata della macchia d'inchiostro sulla superficie era apprezzabile e l'angolo di contatto era <90°; Grado alto: Quando la macchia d'inchiostro era stata definitivamente assorbita, con un angolo di contatto di 0° (Figura 2).

• Analisi SEM. È stata impiegata la microscopia elettronica a scansione per visualizzare immagini ad alta risoluzione delle superfici dei campioni. Utilizzando il SEM, è stata analizzata la topografia superficiale nelle immagini. In particolare, le immagini SEM sono state utilizzate per valutare il tasso di riduzione delle impurità di carbonio con tre diversi tempi di ciclo. Il rivelatore a spettroscopia di raggi X a dispersione di energia (EDS) è stato utilizzato per misurare l'energia dei fotoni emessi nello spettro elettromagnetico dei raggi X e per ottenere informazioni chimiche (la percentuale atomica).

2.5 Analisi Statistica

L'intera analisi dei dati è stata effettuata secondo un piano di analisi predefinito. Un biostatistico con esperienza in odontoiatria ha analizzato i dati utilizzando il software Ky Plot 2.0, Informer Technologies, Inc. NY, USA, senza conoscere i codici di gruppo. Sono stati calcolati i valori medi e le deviazioni standard per ciascuna misurazione. È stato utilizzato un calcolatore del test di Kolmogorov–Smirnov a due campioni per confrontare il tempo di assorbimento tra i gruppi. I confronti statistici sono stati condotti al livello di significatività di 0,05.

Risultati

Un totale di 28 campioni è stato utilizzato. Il tempo di assorbimento e la bagnabilità di 22 campioni dopo che vari inchiostri con diverse tensioni superficiali erano stati applicati su di essi sono stati valutati in entrambi i gruppi. Il trattamento superficiale al plasma in vuoto ha ridotto statisticamente il tempo di assorbimento in tutti i campioni trattati (p valore < 0.05, Tabella 1). Inoltre, per tutti i campioni tranne che per i granuli spugnosi OSTEOXENON con inchiostro a 56 mN/m, la bagnabilità nel gruppo di test era di grado superiore rispetto a quella nel gruppo di controllo. La maggiore differenza nella bagnabilità è stata trovata per la membrana pericardica, con un alto grado nel gruppo di test rispetto a un grado nullo nel gruppo di controllo. I migliori risultati sono stati trovati per il trattamento superficiale al plasma in vuoto dei blocchi ossei, membrane di collagene, membrane pericardiche e innesti ossei in collagene, rispettivamente. Tutti i dati sono riportati nella Tabella 1. Immagini esplicative sono riportate nella Figura 3.

Sei blocchi ossei (tre dopo trattamenti superficiali al plasma in vuoto e tre senza alcun trattamento) sono stati valutati nell'analisi SEM-EDS dopo uno, due e tre cicli di tempo, rispettivamente. Il tasso di riduzione delle impurità di carbonio tendeva ad aumentare dopo tre cicli di tempo rispetto a quello sotto uno e due cicli di tempo. Inoltre, l'analisi SEM-EDS non ha mostrato danni ai biomateriali dopo trattamenti superficiali al plasma in vuoto multipli (fino a tre volte, 90 s, Figura 4), mentre la parte superiore della superficie mostrava una migliore bagnabilità dopo tre cicli di tempo (Figura 5). Tutti questi dati sono riportati nelle Tabelle 2 e 3.

Discussione

Questo studio mirava a valutare se l'effetto del trattamento superficiale al plasma in vuoto su vari biomateriali utilizzati per la preservazione dell'alveolo e le procedure GBR potesse migliorare la loro idrofilicità e bagnabilità. L'idrofilicità è stata misurata attraverso il tempo di assorbimento dell'inchiostro e il grado di bagnabilità. Il tempo di assorbimento dell'inchiostro dei campioni trattati al plasma era significativamente più breve rispetto a quello dei campioni non trattati. Pertanto, l'ipotesi nulla di nessuna differenza è stata parzialmente respinta. Questi test iniziali in vitro hanno indicato che il trattamento superficiale al plasma in vuoto ha avuto un effetto positivo sui blocchi ossei, sulle membrane pericardiche, sulle matrici di collagene e sui innesti ossei in collagene sia in termini di tempo di assorbimento che di grado di bagnabilità. Al contrario, il trattamento superficiale al plasma in vuoto non è riuscito a ridurre il tempo di assorbimento per gli innesti ossei non collagene. Ciò indica che il trattamento superficiale al plasma in vuoto ha convertito le superfici dei biomateriali essiccati da superfici idrofobiche a superfici altamente idrofile. Tuttavia, le caratteristiche superficiali iniziali sono importanti per definire i risultati attesi.

L'aumento del tempo complessivo di trattamento, fino a tre cicli, ha migliorato i risultati. Una possibile spiegazione è che le impurità di carbonio tendono a diminuire dopo tre cicli. In vivo, il trattamento della superficie con plasma in vuoto di una matrice dermica acellulare umana ha mostrato un'infiltrazione migliorata dei fibroblasti, indicando una biocompatibilità migliorata. Nella presente ricerca, il trattamento della superficie con plasma in vuoto ha mostrato alcuni effetti positivi in termini di decontaminazione dei biomateriali trattati e in termini di attivazione delle superfici, riducendo le impurità e aumentando la loro idrofobicità.

Diversi studi nella letteratura hanno confermato l'efficacia dei trattamenti al plasma in termini di adesione cellulare e attività dei fibroblasti. Tuttavia, i principali argomenti di questi studi erano i monconi dentali e le superfici degli impianti.

La bagnabilità della superficie è uno dei parametri più importanti che influenzano la risposta biologica a un materiale impiantato, influenzando l'assorbimento delle proteine, l'adesione/attivazione delle piastrine, la coagulazione del sangue e l'adesione di cellule e batteri. Nella presente ricerca, sono stati utilizzati inchiostri per misurare il tempo di assorbimento e il grado di bagnabilità dei biomateriali testati. La tensione superficiale del sangue gioca un ruolo importante nel corpo umano. Secondo Hrncír e Rosina, la tensione superficiale del sangue, valutata in un gruppo di 71 soggetti sani utilizzando il metodo della goccia a una temperatura di 22 gradi Celsius, era di 55.89 × 10⁽⁻³⁾ N × m⁽⁻¹⁾, con un SD = 3.57 × 10⁽⁻³⁾ N × m⁽⁻¹⁾. Considerando che i cambiamenti nel comportamento della tensione superficiale dei fluidi biologici umani sono caratteristici in alcune malattie, per la presente ricerca sono stati utilizzati inchiostri con tensioni superficiali di 56 mN/m e 72 mN/m.

Analizzando i dati raccolti nella presente ricerca, è stato riscontrato che nel gruppo di controllo, l'inchiostro con una tensione superficiale più alta (72 mN/m) è stato assorbito più rapidamente rispetto all'inchiostro con una tensione superficiale più bassa (56 mN/m) sia dai blocchi ossei che dai Xenomatrix di collagene, ma non dai innesti ossei non collagene. Al contrario, nel gruppo di test, la differenza non era rilevante. Questi risultati potrebbero significare che dopo il trattamento della superficie con plasma in vuoto, le variazioni nella tensione superficiale potrebbero essere meno rilevanti per il processo di guarigione.

Dopo fino a tre cicli di tempo, l'imaging SEM della topografia superficiale non ha rivelato cambiamenti sotto i trattamenti della superficie con plasma in vuoto, e non sono stati osservati danni fisici. L'aumento dell'idrofilicità, la riduzione del grado di impurità e la preservazione della struttura originale, senza alcun danno fisico ai blocchi ossei trattati con plasma, dovrebbero essere considerati come evidenza della migliorata biocompatibilità e potenziale biointegrazione dei materiali testati.

Il trattamento al plasma in vuoto è ampiamente utilizzato in medicina per migliorare la biocompatibilità e la biointegrazione nelle chirurgie ricostruttive. I risultati di una ricerca in vitro simile evidenziano il potenziale del trattamento al plasma per migliorare le prestazioni degli hADM in contesti clinici, offrendo una promettente opportunità per migliorare i risultati della chirurgia ricostruttiva. Inoltre, il trattamento al plasma in vuoto è utilizzato anche in altri campi, come per aumentare le proprietà elettriche dei film di organosilicato o la bagnabilità dei polimeri di polietereterechetone (PEEK).

La principale limitazione della presente ricerca è il numero ridotto di campioni e, naturalmente, la sua natura in vitro. Un'altra limitazione è che l'angolo di contatto di bagnabilità avrebbe dovuto essere fornito invece del livello di grado di bagnabilità. Anche se i risultati della presente ricerca sono incoraggianti per il trattamento superficiale al plasma in vuoto, i dati in vitro non ci permettono di trarre conclusioni cliniche definitive. Tuttavia, l'analisi dei dati dall'analisi SEM-EDS ha rivelato che il tasso di impurità di carbonio sulle superfici dei blocchi ossei tendeva a diminuire all'aumentare del numero di cicli temporali; pertanto, si potrebbe suggerire di aumentare i cicli temporali fino a tre a seconda dei sostituti ossei utilizzati. Inoltre, il tempo di assorbimento e il grado di bagnabilità sono migliorati anche dopo due e tre cicli temporali. Relativamente a quest'ultimo, le membrane di pericardio e i innesti ossei, in particolare gli innesti ossei non collagene, potrebbero essere trattati aumentando il numero di cicli a due o tre per ridurre il grado di impurità di carbonio e aumentare la loro idrofilicità. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi clinici controllati randomizzati per confermare questi risultati preliminari. Un'altra limitazione di questa ricerca è che, poiché non ci sono stati molti studi simili nella letteratura scientifica, non è stato facile definire un criterio per interpretare i risultati, specialmente riguardo al grado di bagnabilità dei sostituti ossei testati e delle membrane riassorbibili. I dati di studi in vitro e in vivo simili hanno confermato l'effetto positivo del trattamento al plasma su impianti e abutment quando si utilizza plasma di argon. Riguardo a quest'ultimo, i dati di questa ricerca in vitro devono essere considerati un rapporto preliminare per incoraggiare ulteriori valutazioni cliniche.

Conclusioni

Il trattamento superficiale al plasma a vuoto ha aumentato statisticamente l'idrofilicità della maggior parte dei biomateriali testati, riducendo il tempo di assorbimento e aumentando il grado di bagnabilità. Inoltre, il tasso di impurità di carbonio potrebbe essere ridotto aumentando il tempo di ciclo. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi controllati randomizzati con calcoli della dimensione del campione per confermare questi risultati preliminari.

Marco Tallarico, Silvio Mario Meloni, Michele Troia, Carlotta Cacciò, Aurea Immacolata Lumbau, Ieva Gendviliene, Francesco Mattia Ceruso e Milena Pisano

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