Scelta delle pecore (Ovis aries) come modello animale per la ricerca sull'articolazione temporomandibolare: Caratterizzazione morfologica, istologica e biomeccanica del disco articolare

Riassunto

I trial preclinici sono essenziali per lo sviluppo delle tecnologie scientifiche. Sono state condotte ricerche molecolari e cellulari notevoli utilizzando modelli animali piccoli. Tuttavia, esistono differenze significative riguardo al comportamento articolare tra questi modelli e gli esseri umani. Pertanto, i modelli animali grandi potrebbero essere più appropriati per eseguire trial che coinvolgono l'articolazione temporomandibolare (ATM). L'obiettivo di questo lavoro era effettuare una caratterizzazione morfologica (dissezione anatomica e sistema di scansione 3D a luce bianca), istologica (l'ATM in blocco è stata rimossa per analisi istologica) e biomeccanica (test di tensione e compressione) dell'ATM delle pecore confrontando i risultati ottenuti con i dati umani. I risultati hanno mostrato che il processo condiloide e la fossa mandibolare delle pecore sono anatomica mente simili alle stesse strutture umane. Il disco dell'ATM ha un perimetro ellittico, più sottile al centro che in periferia. L'area periferica funge da struttura ad anello che supporta la zona centrale. Le cellule del disco mostrano morfologie simili a fibroblasti e condrociti. L'area marginale è formata da tessuto connettivo lasso, con alcune cellule simili a condrociti e fibre di collagene in diverse orientamenti. I dischi hanno ottenuto un modulo di trazione di 3.97 ± 0.73 MPa e 9.39 ± 1.67 MPa, per la valutazione anteroposteriore e mediolaterale. I dischi dell'ATM hanno presentato un modulo di compressione (E) di 446.41 ± 5.16 MPa e il loro valore massimo di stress (σmax) era di 18.87 ± 1.33 MPa. I risultati ottenuti suggeriscono che questi animali dovrebbero essere considerati come un modello primario per la ricerca sull'ATM e la formazione procedurale. Ulteriori indagini nel campo della chirurgia oromaxillofaciale che coinvolgono l'ATM dovrebbero considerare le pecore come un buon modello animale a causa della loro somiglianza con la stessa articolazione negli esseri umani.

Introduzione

Per migliorare la salute umana, le scoperte scientifiche e le tecnologie devono essere tradotte in applicazioni pratiche. Tali progressi iniziano classicamente con la ricerca di base e poi progrediscono a livello clinico. Inerente allo sviluppo di nuove tecnologie è il ruolo delle prove precliniche utilizzando modelli animali. Sebbene nessun modello animale possa replicare completamente le condizioni umane, i modelli animali sono fondamentali per la valutazione dei meccanismi di malattia, il test di nuove tecnologie e l'applicazione di nuove procedure. L'articolazione temporomandibolare (ATM) è l'articolazione più frequentemente utilizzata nel corpo umano. L'ATM si apre e si chiude 1500—2000 volte al giorno ed è essenziale per le funzioni quotidiane della bocca come la masticazione, il linguaggio, la deglutizione, lo sbadiglio e il russare, coinvolgendo una sinergia obbligatoria di entrambi i lati articolari. Le superfici articolari sono convesse e, pertanto, movimenti articolari fluidi sono possibili solo grazie a un disco intra-articolare tra di esse. Il disco dell'ATM è un componente essenziale nell'ATM normale e ha le seguenti funzioni: distribuisce il carico intra-articolare, stabilizza le articolazioni durante la traduzione e diminuisce l'usura della superficie articolare. Un disco dell'ATM spostato, malformato o danneggiato può indurre processi patologici di dislocazione interna e/o osteoartrite. Attualmente, i pazienti che soffrono di grave disfunzione temporomandibolare (DTM) hanno poche opzioni di trattamento. Senza impianti di disco dell'ATM sicuri ed efficaci, molti pazienti subiscono una discectomia: una procedura chirurgica che rimuove il disco dell'ATM danneggiato con l'obiettivo di ridurre i sintomi gravi della DTM. Questa procedura potrebbe non essere ideale poiché l'ATM viene lasciata senza una struttura funzionale importante. A causa dei problemi precedenti associati ai materiali alloplastici utilizzati per sostituire il disco dell'ATM come silicone e Proplast-Teflon (PTIPI, Vitek, Inc, Houston, Texas, USA), molti gruppi hanno abbandonato l'indagine in questo campo. Tuttavia, l'impatto potenziale di un impianto interposizionale temporomandibolare sintetico (TII) è immenso. I fallimenti del TII sintetico sono stati generalmente attribuiti alla mancanza di conoscenza riguardo agli aspetti biomeccanici e biochimici dell'ATM. Lo sviluppo di nuove tecnologie per l'ingegneria dei supporti riguardanti il disco dell'ATM è in crescita e il modello animale ideale per la ricerca sull'ATM dovrebbe essere ben caratterizzato. La scelta di un animale per il design sperimentale non è semplice. A causa delle differenze fisiologiche e anatomiche tra l'ATM umana e quella degli animali sperimentali, non esiste un modello animale che sia valido di per sé. L'ATM è una caratteristica cardinale che definisce la classe Mammalia e separa i mammiferi dagli altri vertebrati. L'ATM mostra notevoli variazioni morfologiche e funzionali tra le diverse specie, riflettendo non solo la grande adattamento dei mammiferi ai meccanismi di alimentazione, ma anche diversi comportamenti biomeccanici. Le variazioni morfologiche sono correlate sia al carico (ad es. dimensione delle superfici articolari) sia al movimento (ad es. orientamento dell'articolazione), o entrambi. Il carico dell'ATM è una forza di reazione derivante dalla contrazione dei muscoli masticatori; la sua magnitudine dipende fortemente dalla posizione del punto di morso rispetto alla linea d'azione del muscolo. Molti animali da laboratorio comunemente usati, specialmente i roditori, rientrano nella categoria di carico minimo dell'ATM, specialmente durante la masticazione. Al contrario, i carnivori come i cani sostengono carichi dell'ATM che sono superiori a quelli dei primati. L'apertura della mandibola di solito comporta una combinazione di rotazione e scivolamento in avanti (traduzione), ma alcuni carnivori hanno perso la capacità di scivolare e alcuni formichieri specializzati usano invece una rotazione attorno all'asse lungo della mandibola curva. Le varianti evolutive più estreme includono:

• perdita della cavità sinoviale in alcune balene con fanoni;

• perdita (o forse assenza primitiva) del disco nei monotremi, in alcuni marsupiali e in alcuni edentati (formichieri e bradipi);

• variazioni nell'orientamento della cavità articolare da sagittale (molti roditori) a trasversale (molti carnivori);

• inversione della consueta relazione convessa/concava in modo che il processus condylaris diventi l'elemento femminile (molti ungulati artiodattili come pecore e bovini).

Inoltre, la dimensione relativa dell'articolazione è estremamente variabile. Pecore, conigli e scimmie sono stati utilizzati come modelli di difetto del disco dell'ATM in molti studi. Il modello scimmia è stato raramente utilizzato negli ultimi anni, considerando l'alto costo, la difficile operazione chirurgica e l'approvazione etica. Il coniglio è un'ottima opzione per gli studi sulla dislocazione anteriore del disco dell'ATM, ma la piccola dimensione dell'ATM aumenta la difficoltà per l'approccio chirurgico e la manipolazione del disco. Gli autori concordano con altri studi considerando che le pecore siano un'opzione valida per gli studi sull'ATM a causa della dimensione dell'ATM, della forma del processus condylaris e della fossa mandibularis, della dimensione del disco, della morfologia e degli attacchi. Tuttavia, manca nella letteratura disponibile una caratterizzazione biochimica e biomeccanica approfondita dell'ATM delle pecore. Pertanto, l'obiettivo del presente studio era esaminare le proprietà morfologiche, istologiche e biomeccaniche dei dischi dell'ATM estratti da pecore (Ovis aries). Si ipotizzava che questi dischi presentassero un'alta somiglianza con i dati disponibili sull'ATM umano.

Materiali e metodi

Il materiale utilizzato per questo studio è stato ottenuto da pecore macellate per il consumo di carne. Sono state utilizzate un totale di 15 teste di pecore femmine Black Merino, di 40-50 kg: 6 per la caratterizzazione morfologica, 4 per la caratterizzazione istologica e 5 per i test biomeccanici. Uno dei principali requisiti per questo studio era l'uso di dischi TMJ freschi; per questo motivo, un team di chirurghi certificati era disponibile 5 giorni alla settimana per raccogliere dischi TMJ freschi fino a un massimo di 5 ore dopo la morte.

Per quanto riguarda le considerazioni etiche sugli animali, il presente disegno dello studio è stato approvato dall'Autorità Nazionale Portoghese per la Salute Animale.

Caratterizzazione morfologica

Per la caratterizzazione morfologica sono stati raccolti 12 dischi TMJ freschi da sei teste di pecore. È stata eseguita una discectomia chirurgica per esporre e identificare le strutture anatomiche del TMJ. Tutti gli attacchi muscolari sono stati rimossi per ottenere dischi TMJ puliti. I dischi sono stati immersi per 5 minuti in una soluzione ColorBond, un infiltrante a rapida essiccazione, progettato per rinforzare rapidamente parti stampate in 3D. Questa immersione è stata essenziale per mantenere la corretta morfologia per la scansione 3D. È stato utilizzato un sistema di scansione 3D a luce bianca (Steinbichler — COMET 5^®) e il software appropriato per replicare i dischi in un modello virtuale 3D. Una volta rimossi i dischi, due dei teschi sono stati bolliti in acqua (120ºC) per 2 ore per consentire l'ottenimento di crani puliti e completi.

Caratterizzazione istologica

Quattro teste di pecora sono state utilizzate per condurre l'indagine istologica. Le ATM sono state rimosse utilizzando una sega ossea oscillante da necroscopia secondo i seguenti riferimenti anatomici: craniale — aspetto craniale del processo coronoideus nella sezione dell'arcus zygomaticus; caudale — esterno al meatus acusticus. Il riferimento dorsale è stato stabilito sul osso temporale squamoso. Il riferimento ventrale era 2 cm ventrale al meatus acusticus nella zona dell'angulus stylohyoideus.

Le articolazioni sono state fissate in formalina tamponata al 10% per dieci giorni. La decalcificazione è stata ottenuta mediante immersione in acido formico al 10% per tre settimane, dopo di che le articolazioni sono state tagliate sagittalmente e trasversalmente attraverso l'intero processo condilare. Dopo un lavaggio intensivo, i frammenti sono stati sottoposti a un trattamento tissutale di routine con inclusione in paraffina. Sezioni di quattro micron sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E) e con Orceina per mostrare le fibre elastiche nel disco. Immagini digitali sono state ottenute con una fotocamera Olympus DP21.

Test biomeccanici

Cinque teste di pecora sono state utilizzate per studi biomeccanici. I dischi dell'ATM sono stati rimossi e immersi in una soluzione salina per il trasporto fino ai laboratori di bioingegneria (massimo 1 ora). Tutti gli attacchi muscolari e i legamenti sono stati rimossi per ottenere un disco fibrocartilagineo pulito. Sono stati ottenuti dieci dischi puliti, ma uno è stato escluso a causa di danni chirurgici. Di conseguenza, 9 dischi sono stati randomizzati in 3 gruppi e testati in diversi test meccanici: il modulo di trazione (E), la resistenza alla trazione e l'allungamento sono stati testati in: test anteroposteriore (APT) e test mediolaterali (MDT).

I test di compressione (CT) sono stati eseguiti utilizzando test di stress-deformazione. Nel caso del test di trazione anteroposteriore, durante il caricamento, i dischi dell'ATM sono stati allungati nella direzione rappresentata su Fig. 1A, mentre nel test di trazione mediolaterale la direzione di allungamento era come mostrato su Fig. 1B.

Risultati

Caratterizzazione morfologica

Nei capi di pecora studiati, l'ATM era situata, come previsto, nel segmento posteriore del lato del viso, cranioventrale al meato acustico esterno, essendo un'articolazione diartrodiale, bicondilare che consente l'apertura e la chiusura normale della mandibola. Comprendeva la faccia articolare superiore, la fossa mandibularis dell'osso temporale e il processus condylaris, come superficie articolare inferiore (Figg. 2 e 6). È stato notato un processus coronoideus sporgente (Fig. 2).

La superficie articolare superiore (fossa mandibularis) si trovava nella zona inferiore dell'osso temporale, laterale al forame ovale e anteriore al meato acustico esterno. La fossa mandibularis era anteroposteriore più grande che mediolaterale con una convessità verso il basso. La superficie articolare inferiore (Fig. 3) è rappresentata dal processus condylaris, con forma ellissoidale con l'asse più lungo in posizione mediolaterale, le misure medie erano di 23,47 mm di lunghezza (σ = 0,87) e 8,32 mm di larghezza (σ = 1,54). Il processus condylaris era concavo mediolateralmente. La fossa mandibularis riceve il processus condylaris.

Con un approccio chirurgico semplice, gli autori hanno localizzato il disco articolare fibrocartilagineo interposto tra la fossa mandibolare e il processo condilare (Fig. 4). Questo disco separa una cavità articolare superiore da una inferiore. La prima era costantemente più grande della seconda. Le strutture ossee erano rivestite di cartilagine, più evidente nel processo condilare.

Nelle pecore studiate, il disco articolare aveva una forma ellittica, risultando sostanzialmente più sottile al centro che alla periferia. Le regioni del disco dell'ATM sono comunemente classificate come banda anteriore, banda posteriore e zona intermedia (Fig. 5). La zona intermedia presenta differenze tra i suoi aspetti laterali e mediali, essendo spesso suddivisa in regione laterale, mediale e centrale. Le bande del disco sono più spesse della zona intermedia.

La lunghezza e la larghezza medie dei 12 dischi TMJ freschi analizzati erano rispettivamente di 21,23 mm (σ = 1,53) e 11,49 mm (σ = 0,62). Gli spessori delle bande anteriore e posteriore erano di 1,05 mm (σ = 0,07) e 1,27 mm (σ = 0,04), rispettivamente. Lo spessore centrale medio era di 0,76 mm (σ = 0,09).

Le stesse misure ottenute dai modelli virtuali 3D erano totalmente simili a quelle registrate nei dischi freschi. Un rapporto importante e coerente con tutte le TMJ era la presenza di fluido viscoso nel compartimento superiore e inferiore. Questo fluido non è stato analizzato.

Caratterizzazione istologica

Lo studio istologico della TMJ delle pecore ha rivelato che il disco articolare era attaccato anteriormente e posteriormente alla capsula articolare composta da tessuto fibroso. Sia la fossa mandibolare che le superfici del processo condilare erano coperte da uno strato fibrocartilagineo. Tuttavia, lo strato fibrocartilagineo che copriva il processo condilare era considerevolmente più spesso dello strato che copriva la fossa mandibolare (Fig. 6).

La parte centrale sottile del disco era composta da fibroblasti sparsi e fasci di fibre di collagene spesse e densamente impacchettate disposte principalmente in direzione anteroposteriore. Le fibre di collagene non erano dritte ma mostrano evidenze di un contorno ondulato. Le porzioni anteriore e posteriore del disco erano a loro volta occupate da fasci di fibre di collagene con diverse orientamenti (Fig. 7). In alcune aree, queste due porzioni mostrano cellule simili a condrociti residenti in lacune distribuite tra fibre di collagene meno compatte (Fig. 7). Ogni lacuna era circondata da una minima quantità di matrice amorfa. La banda posteriore si mescolava, nello spazio retrodiscale, con tessuto connettivo lasso con abbondante apporto di sangue e nervi. Sono stati osservati alcuni vasi sanguigni di piccolo calibro, circondati da tessuto connettivo lasso, in tutte le parti del disco (Fig. 7). Inoltre, erano presenti occasionali adipociti uniloculari sia negli attacchi anteriori che posteriori del disco.

Le fibre elastiche positive all'orceina sono state trovate in tutto il disco, apparendo apparentemente più abbondanti nella porzione centrale più sottile. In quest'area del disco, le fibre elastiche erano disposte principalmente in parallelo ai fasci di collagene (Fig. 8). Invece, nelle porzioni anteriore e posteriore del disco, le fibre elastiche mostrano una distribuzione reticolare tra le fibre di collagene e le cellule simili ai condrociti (Fig. 8).

Caratterizzazione biomeccanica

In Tabella 1, sono presentate le misure dei dischi utilizzati nei test meccanici.

I test di trazione eseguiti hanno rivelato che i dischi dell'ATM presentavano comportamenti diversi per le direzioni anteroposteriore e mediolaterale (Fig. 9).

I risultati ottenuti hanno dimostrato che il modulo di trazione dei test di trazione mediolaterali è superiore a quello dei test di trazione anteroposteriori, così come la resistenza alla trazione e l'allungamento a rottura (Figs. 10 e 11).

Nella Tabella 2 sono riassunti i risultati ottenuti per i dischi testati riguardo al modulo di trazione, alla resistenza alla trazione e all'allungamento a rottura.

I test meccanici sotto compressione sono stati eseguiti per valutare le prestazioni macro-meccaniche dei dischi dell'ATM. Fig. 12 dimostra le curve di stress-deformazione compressiva dei dischi testati.

I dischi dell'ATM presentavano un modulo di compressione (E) di 446,41 ± 5,16 MPa e il loro valore massimo di stress (σmax) era di 18,87 ± 1,33 MPa.

Discussione

Il disco dell'ATM è un tessuto fibrocartilagineo specializzato, situato tra il processo condilare e la fossa mandibolare come mostrato nella nostra caratterizzazione morfologica delle pecore. Negli esseri umani, il disco dell'ATM ha un perimetro ellittico, più sottile al centro rispetto alla periferia. La periferia del disco funge da struttura ad anello che sostiene la zona centrale. Lo stesso è stato osservato nella morfologia del disco delle pecore. Le funzioni del disco dell'ATM sono:

• migliorare l'adattamento tra le superfici ossee;

• fornire stabilità durante i movimenti mandibolari;

• distribuire le forze masticatorie.

Questa capacità è dovuta all'alta concentrazione di fibre di collagene. Questa struttura ad anello attorno al disco è un aspetto strutturale importante per supportare le connessioni del disco. L'area di connessione è ricca di fibre elastiche, che sono essenziali per la mobilità del disco nell'articolazione. Come è stato mostrato nella caratterizzazione morfologica dell'ATM delle pecore, questa struttura anatomica ha rivelato diverse caratteristiche simili all'ATM negli esseri umani, inclusa la lunghezza del diametro mediolaterale che è maggiore di quella anteroposteriore, l'asse lungo del processus condylaris che si dirige all'indietro e una maggiore inclinazione condilare anteriore. Una delle principali differenze è la forma concava del processus condylaris mediolaterale che è convessa negli esseri umani. Il processus condylaris forma una piccola depressione anteroposteriore e mediolaterale per adattarsi esattamente nella fossa mandibularis, a differenza del processus condylaris umano, che è arrotondato anteroposteriormente e mediolateralmente. La fossa mandibularis è anteroposteriormente più grande di quella mediolaterale con una convessità verso il basso, contrariamente alla fossa mandibularis negli esseri umani che è concava verso l'alto. La fossa mandibularis consente il libero movimento mediolaterale del processus condylaris per la ruminazione. Il tubercolo articolare, una caratteristica speciale negli esseri umani, è rudimentale nelle pecore, poiché il percorso del movimento del processus condylaris è mediolaterale, contrariamente a quello negli esseri umani, che è per lo più anteroposteriore. Comparativamente, la fossa e il processus condylaris delle pecore sono molto simili all'ATM umano edentulo, molto più piatti. Architettonicamente, il processus condylaris in entrambe le specie ha anche una sottile corteccia esterna che circonda l'osso midollare composto da osso trabecolare. C'è anche uno strato sottile di fibrocartilagine che copre la superficie condilare e l'intera fossa mandibularis, indicando le parti dell'articolazione temporomandibolare che sono soggette al carico più elevato. La relazione dell'ATM con il meato acustico esterno, il forame ovale e la posizione del disco articolare che interpone il processus condylaris e la fossa mandibularis sono simili all'anatomia dell'ATM umano. La morfologia del disco dell'ATM è molto simile a quella del disco dell'ATM umano. La scelta delle pecore come modello animale per gli studi sull'ATM è stata utilizzata per diversi anni. Gli impianti del disco dell'ATM possono essere un complemento efficace nella ricostruzione articolare bioingegnerizzata e i modelli animali possono offrire la possibilità di condurre studi preclinici informativi. Uno dei problemi più importanti per creare un TII efficace è replicare le caratteristiche biomeccaniche del disco nativo. Pertanto, le informazioni sulle proprietà biomeccaniche del materiale sostitutivo sono indispensabili per ulteriori indagini nell'ingegneria dei tessuti del disco dell'ATM. Durante i movimenti mandibolari, il disco dell'ATM è soggetto a una moltitudine di diversi regimi di carico. Il disco dell'ATM si comporta come una struttura viscoelastica che funge da assorbitore di stress e distributore di stress. Le fibre elastiche svolgono un ruolo importante fornendo al disco la necessaria struttura viscoelastica. Durante ogni tipo di carico, il disco subisce una deformazione, mentre forze interne vengono prodotte all'interno del tessuto. Le forze interne sono quantificate dalla quantità di stress, che è definita come forza per unità di area in Pa (1 Pa = 1 N/m2). Ci sono solo due studi disponibili sul disco dell'ATM bovino in cui il modulo di trazione e il modulo di compressione sono stati confrontati utilizzando lo stesso protocollo sperimentale e materiale. In questi studi, il modulo di trazione variava tra 22 e 26 MPa, e il modulo di compressione tra 14 e 17 MPa. I dati sui dischi dell'ATM suino, canino e umano sono disponibili nella letteratura, ma i metodi utilizzati per l'ottenimento e l'elaborazione del disco non sono sempre chiari. I moduli di trazione riportati sono approssimativamente 0,5—80 MPa, 20—25 MPa e 40—100 MPa, rispettivamente, per i modelli animali sopra citati. Al fine di valutare il comportamento meccanico dei dischi dell'ATM delle pecore, gli autori riportano, per la prima volta, come sia stato possibile stimare, il modulo di trazione anteroposteriore e mediolaterale e il modulo di compressione. L'uso di dischi dell'ATM freschi ha contribuito a rendere i risultati rappresentativi della realtà. I movimenti mandibolari delle pecore sono per lo più mediolaterali, spiegando la migliore performance del disco dell'ATM nel sostenere la tensione nella direzione mediolaterale. In conclusione, le pecore sembrano essere un eccellente modello sperimentale per studi sull'ATM, essendo una grande specie con molte somiglianze anatomiche rispetto alla struttura umana in relazione all'approccio chirurgico, alle dimensioni delle strutture anatomiche, alla forma e alla posizione del processus condylaris. Il disco dell'ATM sembra essere molto simile al disco dell'ATM umano per quanto riguarda morfologia, istologia e biomeccanica. È intenzione dell'autore che il presente lavoro aiuti ulteriori ricerche nel campo dell'oromaxillofacciale condotte su pecore come un'eccellente alternativa ad altre specie animali sperimentali più convenzionali, anche più adatte per la formazione chirurgica procedurale.

D.F. Angelo, P. Morouço, N. Alves, T. Viana, F. Santos, R. González, F. Monje, D. Macias, B. Carrapiço, R. Sousa, S. Cavaco-Gonçalves, F. Salvado, C. Peleteiro, M. Pinho

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