Valutazione con Micro-CT dell'efficacia della rimozione di tessuti duri dal canale radicolare e dall'area dell'istmo mediante sistemi di irrigazione a pressione positiva e negativa
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Abstract
Obiettivo: Valutare la rimozione dei detriti di tessuto duro accumulati (AHTD) dal sistema canalare delle molari mandibolari mediante sistemi di irrigazione a pressione positiva e negativa, utilizzando l'analisi di imaging micro-CT.
Metodologia: Le molari mandibolari con un singolo canale nella radice distale e 2 canali collegati da un istmo nella radice mesiale sono state abbinate in base a dimensioni morfologiche simili utilizzando la valutazione micro-CT e assegnate a 2 gruppi sperimentali (n = 20 canali mesiali e 10 distali), secondo il protocollo di irrigazione: pressione positiva apicale (irrigazione convenzionale) o pressione negativa (sistema EndoVac). Le variazioni nel volume del canale radicolare e nell'area superficiale, così come la percentuale di superficie del muro del canale non strumentato e i detriti di tessuto duro accumulati (AHTD) dopo la preparazione del canale sono stati confrontati statisticamente utilizzando il test t per campioni indipendenti e il test U di Mann-Whitney, con il livello di significatività fissato al 5%.
Risultati: Volume, area superficiale e percentuale di voxel statici nei sistemi canalari mesiali o distali non erano significativamente diversi tra i gruppi prima o dopo la preparazione del canale radicolare (P > 0.05). Dopo la preparazione, l'AHTD non è stato osservato nel canale distale di entrambi i gruppi. Tuttavia, nel sistema canalare mesiale, il gruppo di irrigazione convenzionale era associato a una percentuale mediana significativamente più alta di AHTD (11.48%; IQR: 5.9–22.6; intervallo: 1.86–41.98) rispetto al gruppo EndoVac (3.40%; IQR: 1.5–7.3; intervallo: 0.82–12.84) (P < 0.05).
Conclusioni: Nessun protocollo di irrigazione è riuscito a rendere il sistema canalare mesiale privo di AHTD; tuttavia, l'irrigazione con pressione negativa apicale ha portato a livelli di AHTD inferiori rispetto all'irrigazione convenzionale.
Introduzione
I risultati del trattamento canalare dipendono da procedure efficaci di pulizia e disinfezione dei canali, che eliminano o controllano gli agenti causali della parodontite apicale. In termini di pulizia, strumenti e soluzioni/regimi di irrigazione sono stati valutati principalmente per la loro capacità di rimuovere i residui di tessuto molle utilizzando analisi istologiche (Walton 1976, Zuolo et al. 1992, Siqueira et al. 1997, Taha et al. 2010, De-Deus et al. 2011). Recentemente, diversi autori si sono anche concentrati sull'accumulo di detriti di tessuto duro (AHTD) in recessi, isthmi, irregolarità e ramificazioni utilizzando l'imaging micro-tomografico computerizzato (micro-CT) (Paqué et al. 2009, 2011, 2012a, Robinson et al. 2013, De-Deus et al. 2015). Questa tecnologia ha permesso ai ricercatori di monitorare e quantificare l'accumulo e la rimozione di detriti radiopachi in varie aree del sistema canalare (Robinson et al. 2012, De-Deus et al. 2014, 2015).
I detriti di tessuto duro si formano durante l'azione di taglio degli strumenti sul dente e possono essere accumulati in alcune aree del sistema del canale radicolare. Nei canali infetti, i detriti di tessuto duro possono contenere batteri e fungere da nidus per la reinfezione del canale radicolare. Inoltre, i detriti accumulati nel sistema del canale possono compromettere una disinfezione e un riempimento accurati (Metzger et al. 2010). Studi hanno dimostrato che le attuali tecniche di strumentazione non sono in grado di fornire canali privi di detriti di tessuto duro (Paqué et al. 2011, 2012a,b, Robinson et al. 2013, De-Deus et al. 2015). Poiché i detriti di tessuto duro vengono solitamente generati durante la strumentazione, migliorare l'irrigazione è concepibilmente il modo migliore per prevenire la formazione o rimuovere i detriti accumulati.
Numerose soluzioni irriganti e sistemi di somministrazione sono stati utilizzati nella preparazione del canale radicolare (Gu et al. 2009, Haapasalo et al. 2014). L'irrigazione convenzionale o standard utilizza vari tipi di aghi adattati a una siringa di plastica monouso associata a una pressione positiva apicale. L'uso di aghi irriganti flessibili, che dovrebbero essere inseriti nel canale il più vicino possibile alla lunghezza di lavoro, associato a grandi volumi di irriganti e frequenti scambi è una strategia per migliorare gli effetti di pulizia e disinfezione dell'irrigazione convenzionale (Chow 1983, Siqueira et al. 2000, Sedgley et al. 2005). Il sistema EndoVac (SybronEndo, Orange, CA, USA) comprende un diverso regime di irrigazione che prevede una pressione negativa apicale ed è composto da 3 componenti di base: un beccuccio di somministrazione principale, una macrocannula di plastica e una microcannula in acciaio inossidabile. Il primo viene utilizzato per somministrare ed evacuare l'irrigante contemporaneamente a livello della camera pulpare, mentre le 2 cannule vengono utilizzate in profondità nel canale in sequenza per migliorare l'irrigazione a livello del canale apicale. Poiché queste cannule vengono utilizzate per aspirare l'irrigante, si crea un flusso corrente in direzione apicale (Gu et al. 2009). Il sistema EndoVac può essere considerato sicuro quando utilizzato con NaOCl (Desai & Himel 2009), come confermato da studi che mostrano una bassa estrusione di NaOCl per l'irrigazione EndoVac rispetto ad altri regimi (Mitchell et al. 2010, Iriboz et al. 2015). Per quanto riguarda gli effetti di pulizia e disinfezione, studi che confrontano EndoVac con l'irrigazione convenzionale hanno mostrato risultati inconcludenti. Mentre alcuni autori hanno riportato una migliore pulizia del canale apicale (Nielsen & Craig Baumgartner 2007, Siu & Baumgartner 2010) e una superiore eliminazione batterica (Hockett et al. 2008) utilizzando l'EndoVac, altri studi non hanno riportato differenze significative nella pulizia (Howard et al. 2011) o nella disinfezione (Brito et al. 2009, Miller & Baumgartner 2010, Pawar et al. 2012).
Nonostante l'enorme quantità di ricerche condotte sull'irrigazione dei canali radicolari utilizzando diverse metodologie (Haapasalo et al. 2014), fino ad oggi solo uno studio ha tentato di valutare la riduzione dell'AHTD nei canali radicolari dei molari mandibolari utilizzando il sistema EndoVac (Freire et al. 2015). Pertanto, lo scopo di questo studio ex vivo era di valutare l'efficacia della detersione dei canali radicolari e dell'istmo dei protocolli di irrigazione a pressione positiva apicale (irrigazione convenzionale) e negativa (sistema Endo-Vac) dopo la preparazione dei canali radicolari nei molari mandibolari utilizzando l'analisi di imaging micro-CT. L'ipotesi nulla testata era che non ci fosse differenza nell'efficacia di questi protocolli di irrigazione nella riduzione dell'AHTD all'interno del sistema del canale radicolare dei molari mandibolari.
Materiali e metodi
Selezione e preparazione dei campioni
Dopo l'approvazione del comitato etico, cento sessanta molari mandibolari decoronati a due radici, estratti per motivi non correlati a questo studio, sono stati sottoposti a imaging con uno scanner micro-CT (SkyScan 1174v.2; Bruker-microCT, Kontich, Belgio) impostato a 50 kV, 800 µA e una risoluzione isotropica di 19.89 lm. La scansione è stata eseguita attraverso una rotazione di 180° attorno all'asse verticale con un passo di rotazione di 1° utilizzando un filtro in alluminio spesso 0.5 mm. Le immagini di proiezione acquisite sono state ricostruite in sezioni trasversali (NRecon v.1.6.9; Bruker-microCT), e sono stati ottenuti e valutati modelli 3D dei sistemi di canali radicolari mesiali e distali (CTVol v.2.2.1; Bruker-microCT). Sono stati selezionati venti denti molari con 2 canali indipendenti connessi da un istmo dal terzo medio al terzo apicale della radice mesiale (configurazione del canale di tipo II di Vertucci) e un singolo canale nella radice distale. I parametri morfologici dei canali (curvatura, lunghezza, volume e area superficiale) sono stati registrati (CTAn v.1.14.4; Bruker-microCT), e i campioni sono stati abbinati a coppie di conseguenza. Poi, un dente da ciascuna coppia è stato assegnato casualmente a uno dei 2 gruppi sperimentali, in base alla procedura chemomeccanica (Fig. 1).

Dopo la preparazione della cavità d'accesso, la lunghezza di lavoro (WL) è stata determinata sotto ingrandimento introducendo un file K di dimensione 10 nel canale fino a raggiungere il forame apicale. La WL è stata stabilita
0,5 mm prima del forame. Successivamente, il forame apicale di ciascuna radice è stato sigillato con resina epossidica a rapida essiccazione per creare un sistema a fondo chiuso. Poi, i denti sono stati montati verticalmente fino alla regione cervicale in blocchi realizzati con un materiale per impressioni in silicone (President Jet, Coltène AG, Cuyahoga Falls, OH, USA) per le fasi della procedura chemi-meccanica. Dopo un'irrigazione iniziale con 2 mL di NaOCl al 2,5%, tutti i canali sono stati allargati utilizzando il sistema rotativo BioRaCe (FKG Dentaire, La Chaux-de-Fonds, Svizzera) operato a 500 rpm, in modo crown-down, fino agli strumenti BR5 (dimensione 40, .04 taper) e BR6 (dimensione 50, .04 taper) nei canali radicolari mesiali e distali, rispettivamente. I regimi di irrigazione erano i seguenti (Fig. 1):
- Gruppo di pressione positiva apicale (n = 20 canali mesiali e 10 canali distali): l'irrigazione durante le procedure di preparazione è stata eseguita utilizzando un ago NaviTip da 30 gauge (Ultradent, South Jordan, UT, USA) adattato a una siringa di plastica monouso posizionata fino a 3 mm prima della WL in ciascun canale utilizzando 2 mL di NaOCl al 2,5% dopo ogni strumento. Un ulteriore 4,5 mL di NaOCl al 2,5% seguito da 2,5 mL di EDTA al 17% e 2,5 mL di NaOCl al 2,5% è stato utilizzato nell'irrigazione finale.
- Gruppo di pressione negativa apicale (n = 20 canali mesiali e 10 canali distali): ciascun canale è stato irrigato con 2 mL di NaOCl al 2,5% ad ogni cambio di strumento utilizzando la punta master di EndoVac posizionata sopra l'apertura di accesso. Dopo la preparazione apicale, la macrocannula di plastica (dimensione 55, .02 taper) è stata inserita 3 mm prima della WL e l'irrigazione è stata effettuata con 2 mL di NaOCl somministrato coronariamente dalla punta master per un periodo di 30 s. Poi, la camera pulpare è stata mantenuta piena di irrigante mentre la microcannula (dimensione 32, .02 taper) è stata posizionata alla WL per 6 s; successivamente, la microcannula è stata posizionata a 2 mm dalla WL per altri 6 s. Sono stati effettuati tre cicli di questi movimenti su e giù, risultando in 36 s di irrigazione con NaOCl con la microcannula. Questa procedura di ‘microirrigazione’ è stata ripetuta utilizzando EDTA al 17% come irrigante (3 cicli) e poi con NaOCl (3 cicli). Alla fine dell'ultimo ciclo, la microcannula è stata lasciata alla WL per rimuovere l'eccesso di irrigante.
Il volume totale di NaOCl per gruppo è stato di 13 mL per ciascun canale mesiale e 15 mL per il canale distale. Il volume totale di EDTA è stato di 2,5 mL per canale. La portata dell'irrigante è stata di 2 mL per 30s e 2 mL per 36s durante e dopo la preparazione del canale, rispettivamente (Fig. 1).
Analisi delle immagini Micro-CT
I modelli 3D dei canali radicolari dopo la preparazione sono stati resi e co-registrati con i rispettivi set di dati pre-operatori utilizzando il modulo di registrazione rigida del software 3D Slicer 4.3.1 (disponibile su http:// www.slicer.org). Le immagini abbinate dei canali sono state esaminate per calcolare il volume (mm3), l'area superficiale (mm2) e la quantità di superficie del muro del canale non strumentata (voxel statici) per entrambi i sistemi di canali radicolari mesiali e distali (CTAn v.1.14.4; Bruker micro-CT). Si è ipotizzato che i voxel superficiali rimanenti nello stesso posto dopo la preparazione del canale radicolare (voxel statici) rappresentassero aspetti non strumentati delle pareti del canale (Peters et al. 2001). Successivamente, è stata calcolata la percentuale di aumento dei parametri di volume e area superficiale sottraendo i punteggi dei canali trattati da quelli registrati per i corrispondenti non trattati, per l'intera lunghezza dei canali e per l'area dell'istmo del sistema del canale mesiale. Ai fini di questo studio, la regione di interesse dell'area dell'istmo comprendeva anche l'area di ciascun canale mesiale.
Per l'analisi quantitativa dell'AHTD, le maschere delle etichette dei set di dati registrati di ciascun dente sono state importate nel software Fiji (Fiji v.1.47n; Madison, WI, USA) e normalizzate. La sequenza di immagini risultante da questa operazione è stata ulteriormente utilizzata per identificare l'AHTD mediante operazioni morfologiche. La quantificazione dell'AHTD è stata eseguita mediante la differenza tra lo spazio del canale radicolare non preparato e quello preparato utilizzando procedure di post-elaborazione, espressa come percentuale del volume totale del sistema canalare dopo la preparazione. La presenza di un materiale con densità simile a quella della dentina in regioni precedentemente occupate dall'aria nello spazio del canale radicolare non preparato è stata considerata detrito e quantificata mediante l'intersezione tra le immagini prima e dopo l'istrumentazione del canale (Robinson et al. 2012). I modelli di canale radicolare codificati a colori (colori verde e rosso che indicano le superfici del canale pre e postoperatorie, rispettivamente) e il detrito (in colore nero) hanno consentito un confronto qualitativo dei canali radicolari abbinati prima e dopo la preparazione.
Analisi statistica
Il test di Shapiro–Wilk è stato utilizzato per valutare la normalità dei dati. Prima della preparazione del canale radicolare, i valori di volume e superficie dell'area provenienti dalla regione del canale radicolare o dell'istmo avevano una distribuzione normale e sono stati confrontati tra i gruppi utilizzando il test t per campioni indipendenti. I dati ottenuti dopo la preparazione del canale (volume, superficie, voxel statico e AHTD) erano distorti e espressi come mediana e intervallo interquartile (IQR). Il confronto statistico tra i gruppi è stato effettuato utilizzando il test U di Mann–Whitney non parametrico, e il livello di significatività è stato fissato al 5%.
Risultati
I risultati dei parametri di volume, superficie e voxel statici valutati in entrambi i gruppi, prima e dopo la preparazione, sono dettagliati nella Tabella 1. Pre e postoperatori, il grado di omogeneità (baseline) dei gruppi rispetto alla lunghezza, volume e superficie dei canali radicolari e dell'istmo è stato confermato (P > 0,05). Inoltre, la percentuale di voxel statici dopo la preparazione dei canali radicolari non ha mostrato differenze significative tra i gruppi (P > 0,05).

La figura 2 mostra la distribuzione dell'AHTD dopo la preparazione del canale radicolare utilizzando protocolli di irrigazione a pressione positiva e negativa in due molari mandibolari rappresentativi. Dopo la preparazione, l'AHTD non è stato osservato nel canale distale di entrambi i gruppi. Nel sistema del canale radicolare mesiale, il gruppo di irrigazione convenzionale ha mostrato una percentuale mediana di AHTD significativamente più alta (11.48%; IQR: 5.9–22.6; intervallo: 1.86–41.98) rispetto al gruppo EndoVac (3.40%; IQR: 1.5–7.3; intervallo: 0.82–12.84) (P < 0.05) (Fig. 2). Complessivamente, l'AHTD è stato osservato nei terzi medio e apicale del canale radicolare dopo irrigazione convenzionale, mentre la pressione negativa ha lasciato l'AHTD principalmente nel terzo coronale. Pertanto, l'ipotesi nulla testata è stata rifiutata.

Discussione
I detriti accumulati di tessuto duro possono potenzialmente interferire con la disinfezione impedendo il flusso dell'irrigante e neutralizzando gli effetti antibatterici della soluzione irrigante (Paqué et al. 2012a). Inoltre, possono interferire con il riempimento del canale fisicamente impedendo al materiale di riempimento di raggiungere alcune aree del sistema del canale radicolare (Metzger et al. 2010, Freire et al. 2015). È stato ipotizzato che le particelle di dentina tagliate dalle pareti del canale da strumenti rotanti siano attivamente imballate nei resti di tessuto molle delle aree difficili da raggiungere del canale radicolare e diventino più resistenti alla rimozione mediante irrigazione convenzionale con siringa e ago (Paqué et al. 2009, 2012a). Fino ad oggi, solo pochi studi hanno tentato di indagare diversi schemi di irrigazione per la capacità di ridurre l'AHTD nel sistema del canale radicolare dei molari mandibolari (Paqué et al. 2011, 2012a,b). In generale, la principale conclusione di questi studi è stata che procedure di irrigazione sequenziali o supplementari durante o dopo la preparazione del canale radicolare hanno portato a meno AHTD nei sistemi del canale radicolare contenenti istmi. Utilizzando la tecnologia micro-CT, è stato recentemente riportato che il volume percentuale di AHTD è diminuito dal 4,10% al 2,12% (riduzione percentuale del 53,65%) dopo un protocollo di irrigazione finale utilizzando il sistema EndoVac nel sistema del canale radicolare mesiale dei molari mandibolari (Freire et al. 2015), il che è in accordo con i risultati presenti.
I risultati dello studio attuale hanno rivelato che entrambi i protocolli di irrigazione sono riusciti a rendere i canali radicolari distali privi di AHTD dimostrando l'efficacia del regime di irrigazione convenzionale quando utilizzato in canali radicolari con anatomia singola. Tuttavia, nonostante le sue prestazioni significativamente migliori, EndoVac non è stato in grado di rimuovere completamente l'AHTD dal sistema del canale radicolare mesiale dei denti molari mandibolari. In questa configurazione anatomica del canale, la percentuale mediana di AHTD era significativamente più bassa nei canali irrigati con EndoVac (3,4%) rispetto all'irrigazione convenzionale (11,48%). Questi risultati possono essere spiegati dall'azione di lavaggio meccanico creata dal sistema EndoVac, che è più probabile rimuovere detriti dalle aree difficili da raggiungere del canale radicolare rispetto all'irrigazione con siringa convenzionale (Shin et al. 2010, Siu & Baumgartner 2010).
La pulizia e disinfezione del canale radicolare avviene come una combinazione degli effetti meccanici della preparazione e degli effetti chemomeccanici dell'irrigazione. Poiché il processo di irrigazione è assistito dall'azione di lavaggio meccanico, la velocità di flusso dell'irrigante gioca un ruolo importante per rimuovere i detriti dallo spazio del canale radicolare, durante e dopo la preparazione del canale radicolare. Nel presente studio, la velocità di flusso dell'irrigante è stata impostata a
0,066 mL s—1 (Fig. 1). Anche se alcuni autori hanno raccomandato l'uso di velocità di flusso più elevate nei protocolli di irrigazione positiva (Boutsioukis et al. 2007, Khan et al. 2013), la velocità di flusso di 0,066 mL s—1 è stata scelta nel presente studio a causa dell'impossibilità di applicare una velocità di flusso più elevata con sistemi a pressione negativa apicale (Brunson et al. 2010). Di conseguenza, si può sostenere che una tale bassa velocità per l'irrigazione con siringa potrebbe aver distorto i risultati a favore del sistema a pressione negativa apicale. Tuttavia, in un recente studio in vitro, è stato dimostrato che l'uso di irrigazione a pressione positiva con una velocità di flusso di 4 mL min—1 (o 0,066 mL s—1 come nel presente studio) è stato in grado di raggiungere la massima efficacia (Park et al. 2013).
È importante sottolineare che i gruppi sperimentali in questo studio differivano non solo nel modo di somministrazione dell'irrigante (pressione positiva vs. pressione negativa), ma anche nel protocollo di somministrazione, che non è stato possibile standardizzare. In effetti, questa mancanza di standardizzazione è un problema molto comune negli studi che utilizzano il protocollo del sistema EndoVac, poiché l'irrigante non viene somministrato all'interno del sistema del canale radicolare, ma nella camera pulpare. Nel gruppo di irrigazione con siringa, la punta dell'ago a estremità aperta è stata posizionata a 3 mm dalla WL seguendo la profondità di inserimento della macrocannula plastica EndoVac. Questo livello è stato scelto anche perché studi precedenti hanno riportato che potrebbe migliorare il ricambio dell'irrigante e lo stress di taglio sulle pareti (Shen et al. 2010), riducendo al contempo il rischio di incastro e di estrusione dell'irrigante (Boutsioukis et al. 2014). D'altra parte, nel secondo passaggio della procedura di irrigazione nel gruppo a pressione negativa, la microcannula EndoVac è stata posizionata alla WL, seguendo le raccomandazioni del produttore. Pertanto, nonostante i risultati riportati riflettano vere differenze tra i protocolli testati, rimane poco chiaro in quale misura la differenza nella somministrazione dell'irrigante abbia influenzato i risultati (Adorno et al. 2015), e sono necessari ulteriori studi.
L'azione meccanica degli strumenti sulle pareti del canale include la rimozione dello strato interno di dentina infetta per rimuovere o interrompere i biofilm batterici (Paqué & Peters 2011), il che potrebbe migliorare l'esito del trattamento del canale radicolare. Nel presente studio, la percentuale di pareti del canale radicolare non strumentate è stata espressa come percentuale del numero di superfici voxel statiche rispetto al numero totale di voxel superficiali (Peters et al. 2001). Studi precedenti hanno riportato che la percentuale media di aree non trattate dopo la preparazione con diversi sistemi rotanti variava dal 59% al 79% nei canali distali a forma ovale lunga (Paqué et al. 2010) e dal 39% al 42% nei canali mesiali indipendenti dei molari mandibolari (Yang et al. 2011). Questi alti valori percentuali erano associati alla cinematica degli strumenti rotanti (movimento a picchiettare) e alla presenza di recessi nei canali a forma ovale lunga, che non erano inclusi nella preparazione arrotondata creata dalla rotazione degli strumenti. Nel presente studio, i valori percentuali mediani delle aree non preparate non erano diversi tra i gruppi nel canale distale (27.83% e 23.11%) e nel sistema del canale radicolare mesiale quando l'istmo non era incluso nell'analisi (23.72% e 20.04%, rispettivamente). Questi valori percentuali più bassi rispetto a quelli riportati in precedenza potrebbero essere spiegati come conseguenza di differenze nel protocollo di preparazione, nelle dimensioni degli strumenti e nella configurazione del canale radicolare utilizzata in questo studio.
Il ruolo principale degli studi di laboratorio è sviluppare condizioni ben controllate che siano in grado di confrontare in modo affidabile determinati fattori (Versiani et al. 2013). Uno dei fattori di confondimento più importanti negli studi ex vivo è l'anatomia del sistema canalare radicolare in esame. Di conseguenza, i risultati potrebbero riflettere gli effetti dell'anatomia del canale piuttosto che la variabile di interesse (Peters et al. 2001). Nel presente studio, la distribuzione a coppie dei campioni basata sulla configurazione e morfologia (lunghezza, volume e area superficiale) dei sistemi canalari mesiali e distali ha probabilmente eliminato o, almeno, ridotto sostanzialmente potenziali bias anatomici significativi che potrebbero interferire con i risultati. Pertanto, non sono state osservate differenze riguardo al volume, all'area superficiale e alla percentuale di voxel statici prima o dopo la preparazione del canale radicolare tra i gruppi sperimentali in cui è stato utilizzato lo stesso protocollo di preparazione meccanica (Tabella 1). Pertanto, sulla base dei dati della micro-CT, è possibile migliorare la selezione dei campioni utilizzando parametri morfologici stabiliti per fornire una base coerente, che migliora la validità interna degli esperimenti ex vivo (Versiani et al. 2013, Marceliano-Alves et al. 2015).
Conclusioni
Non è stata osservata accumulazione di detriti duri nei canali distali dei molari mandibolari. Nessun approccio di irrigazione è riuscito a rendere il sistema del canale mesiale privo di AHTD. L'irrigazione con pressione negativa apicale ha portato a livelli significativamente più bassi di AHTD rispetto all'irrigazione convenzionale solo nel sistema del canale radicolare mesiale.
Autori: M. A. Versiani, F. R. F. Alves, C. V. Andrade-Junior, M. F. Marceliano-Alves, J. C. Provenzano, I. N. Rôças, M. D. Sousa-Neto & J. F. Siqueira Jr
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