Creazione di gruppi sperimentali ben bilanciati per studi comparativi di endodonzia in laboratorio: una nuova proposta basata su micro-CT e metodi in silico

Abstract

Obiettivo: Introdurre un nuovo metodo per selezionare denti anatomici corrispondenti utilizzando la tecnologia della microtomografia computerizzata (micro-CT).

Metodologia: Sono stati selezionati incisivi mandibolari monoradicolari con un solo canale radicolare (n = 60) e distribuiti in tre gruppi sperimentali in base al metodo utilizzato per abbinare 10 coppie di denti in ciascun gruppo. Nel gruppo 1, le coppie di incisivi mandibolari sono state selezionate casualmente da un pool di denti. Nel gruppo 2, i denti sono stati abbinati in base alla misurazione della larghezza del canale a 5 mm dall'apice radicolare utilizzando radiografie scattate dalle direzioni buccolinguale e mesiodistale. Nel gruppo 3, i denti sono stati scansionati (dimensione del pixel di 14,25 lm) e abbinati in base agli aspetti anatomici del canale radicolare, denominati rapporto di aspetto (AR), volume e geometria del canale tridimensionale. Dopo aver allocato i campioni nei gruppi 1 e 2, i denti sono stati scansionati e la morfologia del canale valutata come nel gruppo 3. È stata eseguita un'analisi di regressione bivariata di Pearson correlando i valori AR individuali di ciascuna coppia, e il coefficiente di correlazione è stato utilizzato per stimare la forza del processo di abbinamento delle coppie. Sono stati applicati test ANOVA unidirezionali post hoc Tukey per confronti a coppie a un livello di significatività del 5%.

Risultati: La micro-CT ha rivelato che il 100% dei campioni aveva forti (80%) o molto forti (20%) correlazioni rispetto ai valori AR. L'analisi del metodo radiografico ha rivelato una forte correlazione in due coppie (20%), ma la maggior parte dei campioni aveva coefficienti di correlazione deboli (30%) o trascurabili (30%). Il metodo di randomizzazione ha portato a tre coppie (30%) con correlazioni molto forti, mentre il 50% aveva tassi deboli o trascurabili. È stata osservata una differenza significativa nei coefficienti di correlazione nel metodo micro-CT rispetto agli altri gruppi (P < 0.05), mentre non è stata rilevata alcuna differenza tra i metodi radiografici e randomizzati (P > 0.05). I calcoli di Eta-quadrato (g²) hanno dimostrato una dimensione dell'effetto molto alta nel gruppo micro-CT per la selezione delle coppie (0.99) e dimensioni dell'effetto inferiori nei gruppi radiografici (0.67) e randomizzati (0.66).

Conclusioni: Il metodo micro-CT è stato in grado di fornire un migliore controllo dell'effetto confondente che le variazioni anatomiche nella morfologia dentale possono avere sui risultati negli esperimenti con design a coppie abbinate.

Introduzione

I test sperimentali su banco sono stati spesso utilizzati per selezionare e classificare la qualità di una miriade di materiali e tecniche relative alla modellazione dei canali radicolari, all'irrigazione, alla disinfezione e alle procedure di otturazione (Buck et al. 1999, Eldeniz & Ørstavik 2009, Çapar et al. 2014, Passalidou et al. 2018). Tuttavia, i risultati e le conclusioni di alcuni di questi studi comparativi potrebbero non essere affidabili a causa di una generale mancanza di corrispondenza anatomica dei denti prima dell'esperimento (De-Deus 2012). Questa mancanza di standardizzazione rivela una validità interna incoerente e scarsa di questi studi, in linea con l'affermazione di Babb et al. (2009): ‘Sebbene i progetti di test che utilizzano spazi canalari naturali abbiano un'attrattiva pragmatica per i clinici, presentano gravi limitazioni da una prospettiva della scienza dei materiali’. Infatti, la difficoltà di creare una base affidabile utilizzando denti naturali estratti è una conseguenza dell'intricato sistema anatomico del canale radicolare, che è un fattore confondente decisivo.

In generale, i gruppi sperimentali negli studi comparativi sono stati creati selezionando denti a radice singola o multipla randomizzati con un campione limitato (Topçuoğlu et al. 2016, Silva et al. 2017, Pedullà et al. 2019). In pratica, ciò significa una standardizzazione molto scarsa e l'incapacità di garantire la comparabilità sperimentale poiché può generare gruppi sperimentali con grandi variazioni nella linea di base del substrato (Smith & Steiman 1994, També et al. 2014). Di conseguenza, questi studi potrebbero essere stati condotti in condizioni sperimentali dissimili e i risultati potrebbero rivelare l'effetto dell'anatomia del canale radicolare piuttosto che la variabile di interesse, cioè materiali, tecniche e/o strumenti in confronto (De-Deus 2012). Per superare questo problema e ottimizzare il design sperimentale, il matching anatomico della morfologia del canale radicolare dovrebbe essere considerato come un primo passo sperimentale fondamentale di qualsiasi studio comparativo ex vivo in endodonzia. Questo fornirà una linea di base coerente e un miglioramento della validità interna complessiva dello studio. Pertanto, diversi studi hanno tentato di superare il fattore anatomico utilizzando l'esame visivo delle radiografie scattate in diverse angolazioni (Yared & Bou Dagher 1994, Bürklein & Schäfer 2012) allocando i denti in gruppi sperimentali in base alla larghezza del canale radicolare misurata a una certa distanza dall'apice radicolare (Ruckman et al. 2013). Tuttavia, la qualità complessiva di questo approccio metodologico non è basata su evidenze. Si è portati a speculare che questo sia effettivamente lontano dall'ideale, considerando le ben note variazioni della forma del canale lungo la radice (Versiani et al. 2012, 2016a). Un altro approccio suggerisce l'uso di denti controlaterali (Johnsen et al. 2017), che hanno dimostrato di avere un'anatomia simile (Zehnder et al. 2006, Mitchell et al. 2011, Iriboz et al. 2015, Viapiana et al. 2016, Guimaraes et al. 2017). Attraverso l'uso della tecnologia di imaging a tomografia computerizzata micro (micro-CT), è stato dimostrato che i premolari controlaterali mostrano effettivamente un alto grado di simmetria corrispondente e un metodo di simulazione computerizzata (in silico) valido e affidabile è stato sviluppato per abbinare i premolari controlaterali negli studi comparativi endodontici sperimentali (Johnsen et al. 2016, 2017, 2018). Questi risultati, tuttavia, non hanno escluso l'uso di altri tipi di denti, ma hanno suggerito che sarebbe concepibile abbinare denti di individui diversi se sono all'interno di un certo intervallo di somiglianza morfologica (Johnsen et al. 2016). L'intervallo, o il coefficiente di somiglianza accettabile più basso, si baserebbe certamente su ulteriori validazioni e deve ancora essere determinato. Pertanto, questo tipo di repository di database di spazi pulpari non controlaterali aprirebbe a studi estremamente selettivi, oltre che, efficienti in termini di tempo e costi.

Lo scopo del presente studio era introdurre una nuova metodologia per abbinare gli incisivi mandibolari non controlaterali in gruppi sperimentali basati sulla loro morfologia interna attraverso l'uso della tecnologia di imaging micro-CT. Questa proposta mira a migliorare la validità interna degli studi comparativi in endodonzia mediante la creazione di gruppi sperimentali anatomici ben bilanciati rispetto ai metodi convenzionali basati sulla randomizzazione o sull'esame radiografico. Per confermare la somiglianza anatomica dei denti, i dati ottenuti sono stati scrutinati con particolare attenzione al rapporto di aspetto (AR) del canale lungo l'intera lunghezza della radice. Questo parametro può essere considerato un indicatore di somiglianza morfologica tra denti diversi. Inoltre, sono stati affrontati con attenzione anche i vantaggi e i limiti di questa nuova proposta. L'ipotesi nulla testata era che non ci sarebbero state differenze nei coefficienti di correlazione tra i tre metodi testati.

Materiali e metodi

Calcolo della dimensione del campione

Basato sui risultati di Versiani et al. (2013a), è stata stimata una dimensione dell'effetto di 0.7 per il metodo di selezione per ottenere campioni adeguatamente abbinati anatomicamente utilizzando la tecnologia micro-CT. Questo valore è stato inserito in un metodo di correlazione bi-seriale della famiglia t-test in G*Power per Mac 3.1 (Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Düsseldorf, Germania), insieme a un errore di tipo alfa di 0.5 e una potenza beta del 95%. Il software ha indicato un numero di 16 campioni (otto coppie) per gruppo per osservare un effetto significativo dei criteri di selezione utilizzando micro-CT rispetto ai metodi convenzionali basati sulla randomizzazione o sull'esame radiografico.

Selezione del campione e gruppi

Questo studio è stato approvato dal comitato etico istituzionale locale (protocollo 87450517.5.0000.5243). Un totale di 1708 incisivi mandibolari monoradicolati che erano stati conservati per gli ultimi 4 anni in una banca dei denti del Dipartimento di Endodonzia, Università Federale Fluminense, Niterói, Rio de Janeiro, Brasile, erano disponibili per questo esperimento. I criteri di inclusione comprendevano solo denti che non mostravano fratture radicolari, calcificazioni, carie, riassorbimento o formazione incompleta della radice. Da questo insieme di denti, sono stati creati tre gruppi sperimentali secondo i seguenti metodi.

Gruppo 1 – Metodo randomizzato (n = 20)

Da un insieme dei primi 76 incisivi mandibolari raccolti casualmente dal campione originale (n = 1708), è stato possibile raccogliere 20 denti di lunghezza 20 ± 1 mm (dal bordo incisale all'apice anatomico) e distribuirli casualmente in due sottogruppi (n = 10) con l'ausilio di un algoritmo informatico (http://www.random.org).

Gruppo 2 – Metodo radiografico (n = 20)

Da ulteriori 100 incisivi mandibolari raccolti casualmente dal campione originale (n = 1708), è stato possibile selezionare 10 coppie di denti aventi larghezza del canale simile misurata a 5 mm dall'apice anatomico (software FIJI/ImageJ v.1.51n; Fiji, Madison, WI, USA) utilizzando proiezioni radiografiche digitali (sistema radiografico digitale Schick CDR; Dentsply Sirona, Charlotte, NC, USA) prese da entrambe le direzioni buccolinguale e mesiodistale di ciascun campione.

Gruppo 3 – Metodo Micro-CT (n = 20)

Duecentocinquantuno incisivi mandibolari (n = 251) raccolti casualmente dal campione originale (n = 1708) erano necessari per creare due gruppi anatomici abbinati (n = 10) basati su un approccio micro-CT. Così, 251 campioni sono stati scansionati (SkyScan 1173; Bruker microCT, Kontich, Belgio; 70 kV, 114 mA, dimensione del pixel di 14,25 lm, rotazione a 360° con un passo di rotazione di 0,5°, media dei fotogrammi di cinque, utilizzando un filtro in alluminio spesso 1,0 mm) e ricostruiti in sezioni trasversali assiali (software NRecon v.1.7.16; Bruker microCT) con parametri individualizzati per la correzione dell'artefatto ad anello (3–4), limiti di contrasto (0–0,05) e correzione dell'indurimento del fascio (30–45%), risultando in 700–900 immagini in scala di grigi per sezione trasversale per dente dalla giunzione cemento-smalto all'apice. Successivamente, le immagini sezionali sono state segmentate per identificare la configurazione del canale radicolare (Figura 1a) utilizzando una routine automatica nel software FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Fiji). In breve, è stato utilizzato un filtro a medie non locali (Buades et al. 2011) per ridurre il rumore preservando i bordi degli oggetti (Figura 1b), seguito dall'applicazione dell'algoritmo basato su Otsu (Otsu 1979) per la binarizzazione (Figura 1c). Per segmentare il canale radicolare, le tre fasi di 'riempi i buchi' 2D sono state aggiunte alla routine automatica dopo un adeguato ri-taglio del volume per rivelare i tre piani ortogonali (xy, xz e yz). Dopo di che, piccoli pixel residui sono stati automaticamente rimossi con lo strumento 'Mantieni la Regione Più Grande' implementato nel plugin MorphoLibJ (Legland & Arganda-Carreras 2014), che consente l'identificazione della componente connessa più grande, rimuovendo quelle disconnesse (Figura 1d). Da questo punto in poi, sono stati utilizzati solo campioni con un singolo canale radicolare (configurazione del canale di tipo I di Vertucci). Il volume di interesse (VOI) è stato quindi stabilito dalla giunzione cemento-smalto all'apice per misurare i parametri AR e volume del canale radicolare. L'AR è definito come il rapporto tra il diametro maggiore e quello minore ed è stato calcolato in ciascuna sezione trasversale dall'apposizione di un'ellisse che meglio si adatta al canale radicolare utilizzando il plugin Shape Descriptors del software FIJI/ImageJ (Fiji v.1.51n; Fiji; Figura 1e). I risultati dell'AR acquisiti in tutte le fette sono stati tracciati in un grafico (Figura 1f) per descrivere le variazioni della geometria 2D del canale lungo la radice. I canali con AR vicino a 1 presentano una forma arrotondata, mentre i valori di AR superiori a tre indicano una forma di canale ovale o allungata. Il volume (in mm³) è stato calcolato come il volume del canale binarizzato all'interno del VOI utilizzando lo strumento Objects Counter (software FIJI/ImageJ). Modelli tridimensionali (3D) della radice e del canale radicolare di ciascun campione sono stati anche creati utilizzando il software CTAn v.1.18.8 (Bruker microCT) e valutati qualitativamente da entrambe le viste buccale e prossimale con il software CTVol v.3.3 (Bruker microCT; Figura 1g). Dopo di che, è stata effettuata l'assegnazione dei campioni in coppie anatomiche. Prima, sono stati creati sottogruppi di denti in base al volume del canale radicolare con un intervallo di variazione massima di 2 mm³. È stato determinato con l'aiuto di un adeguato test statistico (test di Cronbach's alpha) che indicava un'alta omogeneità dei dati (0,968) quando i campioni erano categorizzati all'interno di questa variazione massima di volume. Inoltre, la geometria 2D dell'intero canale radicolare, rappresentata dalla curva grafica dell'AR (Figura 1f), è stata confrontata. I denti categorizzati all'interno dello stesso intervallo di volume del canale e che mostrano curve grafiche simili sono stati raggruppati nuovamente. Infine, l'aspetto morfologico 3D dei canali radicolari (Figura 1g) in questi gruppi è stato esaminato e i campioni assegnati in due gruppi di denti anatomici abbinati (n = 20) basati su volume simile, grafici AR e rendering 3D dei canali radicolari. Due operatori esperti hanno controllato indipendentemente questi parametri prima della distribuzione dei campioni.

Dopo aver allocato tutti i campioni nei tre gruppi sperimentali, i denti selezionati nei gruppi 1 e 2 sono stati anche scansionati e ricostruiti con il dispositivo micro-CT SkyScan 1173 (Bruker microCT) seguendo gli stessi parametri utilizzati nel gruppo 3. Successivamente, i valori AR in ciascuna sezione trasversale, così come il volume e la configurazione 3D dei canali radicolari sono stati ottenuti dai campioni dei gruppi 1 e 2 e utilizzati per il confronto. Un diagramma di flusso dettagliato della metodologia è mostrato nella Figura 2.

Analisi statistica

È stata eseguita un'analisi di regressione bivariata di Pearson correlando i valori AR individuali di ciascuna coppia. Il coefficiente di correlazione ottenuto per ciascuna coppia è stato utilizzato per stimare la forza della corrispondenza della coppia insieme alle lunghezze delle radici seguendo la regola generale della forza delle correlazioni e categorizzato come molto forte (0.9–1.0), forte (0.7–0.9), moderato (0.5–0.7), debole (0.3–0.5) o trascurabile (0–0.3; Cohen 1988). Successivamente, i coefficienti di correlazione sono stati confrontati tra i gruppi per verificare la somiglianza della loro forza riguardo ai metodi utilizzati per formare campioni abbinati a coppie. Poiché è stata osservata una distribuzione a campana per i coefficienti di correlazione, è stata eseguita una procedura ANOVA unidirezionale seguita da un test HSD di Tukey per confronti a coppie. Inoltre, la dimensione dell'effetto di ciascun metodo è stata calcolata utilizzando l'eta quadrato (g²). Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software Statistical Package for Social Sciences (SPSS v.24; SPSS Inc., Chicago, IL, USA) con un livello di significatività adottato del 5%.

Risultati

La Tabella 1 mostra i coefficienti di correlazione di ciascun dente abbinato a coppie utilizzando i tre metodi di campionamento. Il metodo micro-CT (gruppo 3) ha mostrato il 100% dei campioni classificati come forti (80%) o molto forti (20%) correlazioni riguardo ai valori AR. L'analisi del metodo radiografico (gruppo 2) ha rivelato una forte correlazione in due coppie (20%), ma la maggior parte dei campioni aveva coefficienti di correlazione deboli (30%) o trascurabili (30%). Utilizzando il metodo di randomizzazione (gruppo 1), solo una coppia (10%) è stata classificata con correlazione molto forte e due coppie (20%) con correlazione forte, mentre il 50% ha raggiunto tassi deboli o trascurabili. I test ANOVA unidirezionali post hoc di Tukey hanno trovato una differenza significativa nei coefficienti di correlazione raggiunti dal metodo micro-CT rispetto agli altri gruppi (P= 0.000), mentre non è stata rilevata alcuna differenza tra i coefficienti di correlazione delle coppie radiografiche e randomizzate (P> 0.05). I calcoli di Eta-quadrato (g²) hanno dimostrato una dimensione dell'effetto molto alta nel gruppo micro-CT per la selezione delle coppie (0.99) e dimensioni dell'effetto inferiori nei metodi radiografico (0.67) e randomizzato (0.66). Le Figure 3, 4 e 5 illustrano i risultati ottenuti da campioni rappresentativi abbinati a coppie in ciascun gruppo.

Discussione

La principale sfida nella creazione di gruppi sperimentali ben bilanciati per studi comparativi in endodonzia sono le variazioni nell'anatomia intricata che possono esistere in un gruppo randomizzato di denti. Pertanto, un obiettivo importante degli esperimenti di laboratorio ex vivo deve essere quello di creare un metodo fattibile in grado di superare la variazione interna intrinseca nei denti umani naturali (Versiani et al. 2013a). Prima dello sviluppo della proposta attuale, è stata condotta una ricerca bibliografica per identificare i metodi più comunemente utilizzati per creare campioni di denti abbinati in studi sperimentali in endodonzia. Fondamentalmente, questi metodi miravano a suddividere i campioni in gruppi sperimentali in base alle loro caratteristiche anatomiche. È stato osservato che alcuni studi adottavano un punto della radice, solitamente 5 mm dall'apice anatomico, e misuravano la larghezza del canale radicolare sia in direzione buccale che prossimale, seguendo la metodologia di Wu et al. (2000), per determinare la sua forma (Tinoco et al. 2014, Teixeira et al. 2015, Lee et al. 2019). In altri studi, i campioni vengono allocati dallo stesso gruppo di denti tramite randomizzazione (Topçuoğlu et al. 2016, Silva et al. 2017, Pedullà et al. 2019), mentre alcuni di essi hanno adottato una combinazione di metodi radiografici e randomizzati per formare coppie (Ruckman et al. 2013, Bernardes et al. 2016). Recentemente, alcuni studi hanno iniziato a utilizzare parametri anatomici specifici identificati tramite scansione micro-CT per campioni abbinati (Versiani et al. 2013b, Johnsen et al. 2016, Versiani et al. 2016b, Johnsen et al. 2017, 2018). Infatti, la richiesta di esplorare un protocollo scientifico di screening e abbinamento adeguato da utilizzare negli studi comparativi in endodonzia è stata recentemente sollevata da Xu et al. (2016) nella loro proposta tempestiva e appropriata di utilizzare premolari controlaterali per fornire coerenza di base. Contrariamente a Johnsen et al. (2017), hanno trovato relativamente poche coppie di premolari controlaterali con simmetria anatomica. Tuttavia, in accordo con Johnsen et al. (2017), hanno riscontrato che i denti controlaterali presentavano una simmetria migliore rispetto ai denti non abbinati. La ricerca futura dovrebbe esplorare se la somiglianza dei denti non abbinati selezionati e abbinati attraverso la proposta attuale di utilizzare micro-CT per l'abbinamento sia comparabile con i premolari controlaterali. Tuttavia, la disponibilità di denti premolari controlaterali con apici maturi estratti da pazienti più giovani sottoposti a trattamento ortodontico potrebbe essere limitata.

Lo studio attuale si basava su un ampio materiale umano ex vivo di 1708 incisivi mandibolari. I denti hanno subito un rigoroso processo di selezione per creare due gruppi anatomici abbinati in base a metodi di micro-CT e radiografici e un gruppo assegnato per randomizzazione, con ciascun gruppo composto da 10 coppie di incisivi mandibolari. Il rigoroso metodo di selezione da un ampio repository di denti insieme a un adeguato calcolo della dimensione del campione a priori ha permesso di dimostrare quale gruppo avesse le migliori coppie sperimentali bilanciate di base valutando statisticamente quanto sia forte la somiglianza tra la forma interna del canale radicolare tra le coppie, basata sulle correlazioni dei valori AR trasversali.

I bassi coefficienti di correlazione ottenuti sia dai metodi radiografici che da quelli di randomizzazione nello studio attuale dimostrano che i metodi di randomizzazione e abbinamento radiografico non sono stati in grado di superare la variazione biologica intrinseca nell'anatomia del canale radicolare. Pertanto, l'ipotesi nulla è stata respinta. Questi risultati hanno chiaramente dimostrato come gli studi comparativi endodontici che utilizzano screening e abbinamento non sofisticati richiedano una dimensione del campione maggiore per mostrare differenze reali e statisticamente significative. In effetti, un aumento della dimensione del campione porterà probabilmente a una maggiore precisione poiché le differenze individuali conteranno meno, ma potrebbe raggiungere un punto in cui l'effetto sulla precisione è insignificante (Souza 2014). È importante sottolineare che considerazioni etiche ed economiche sono anche incentivi importanti per non avere dimensioni del campione maggiori del necessario. Pertanto, gruppi abbinati e ben bilanciati possono fornire dimensioni del campione più piccole con una potenza sufficiente per fornire risultati affidabili. Infatti, l'effetto che l'abbinamento del campione di base ha sulla riduzione della dimensione del campione è stato precedentemente dimostrato con risultati notevoli nella ricerca ossea (Banse et al. 1996, Barker et al. 2005).

La metodologia attuale apre a future applicazioni di metodi di corrispondenza 3D e recupero di oggetti (Hilaga et al. 2001, Osada et al. 2001, Tangelder & Veltkamp 2008) con capacità di apprendimento profondo o reti neurali artificiali (Hilaga et al. 2001, Ekert et al. 2019, Krois et al. 2019). Tali capacità incorporate in un'interfaccia user-friendly e semi-automatica consentirebbero una rapida selezione in silico dei denti con la morfologia del canale radicolare desiderata, come i canali a forma ovale, e poi raccogliere fisicamente i campioni da una biobanca di denti disponibili per una moltitudine di diversi esperimenti comparativi endodontici con alta validità interna. Il nuovo metodo micro-CT presentato qui rimuove efficacemente l'effetto confondente che le variazioni anatomiche nella morfologia del canale radicolare possono avere sui risultati in progetti sperimentali abbinati. Questo avrà implicazioni inequivocabili per la distribuzione dei campioni nei gruppi sperimentali al fine di migliorare il design degli studi comparativi in endodonzia.

Conclusione

L'uso della Micro-CT è stato in grado di fornire un migliore controllo dell'effetto confondente che le variazioni anatomiche nella morfologia dentale possono avere sui risultati negli esperimenti con design abbinato.

Autori: G. De-Deus, M. Simões-Carvalho, F. G. Belladonna, M. A. Versiani, E. J. N. L. Silva, D. M. Cavalcante, E. M. Souza, G. F. Johnsen, H. J. Haugen, S. Paciornik

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