Frequenza del DNA dei principali tipi di virus oncogeni nella struttura del carcinoma squamoso e della mucosa orale normale
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Riepilogo
Rilevanza. L'incidenza dei tumori maligni della mucosa orale, e soprattutto la mortalità associata a questa patologia, rimane ancora a un livello significativo in Russia. Pertanto, la ricerca di fattori prognostici e predittivi informativi rappresenta un compito attuale per gli specialisti che si occupano del trattamento dei tumori della mucosa orale.
Obiettivo. Determinare la frequenza di rilevamento del DNA di virus oncogeni nella mucosa normale e nelle lesioni di carcinoma squamoso della mucosa orale.
Materiali e metodi. È stato condotto uno studio prospettico che ha incluso 50 volontari sani e 116 pazienti con carcinoma squamoso della mucosa orale verificato per la prima volta. A tutti i soggetti esaminati è stato effettuato il rilevamento del DNA di VZV di tipo I, II, CMV, EBV, HPV di tipo 6, 11, HPV di tipo 16 e HPV di tipo 18 mediante PCR in tempo reale.
Risultati. È stata riscontrata una frequenza significativamente più bassa del DNA del HPV-18 nei pazienti con carcinoma squamoso rispetto alla mucosa normale (l'HPV-18 è stato riscontrato 2,8 volte meno frequentemente (p < 0,0001)). Nella struttura del carcinoma squamoso e della mucosa normale della cavità orale è stata riscontrata un'associazione significativamente più frequente della mucosa normale della cavità orale con l'HPV-18, sia in monoassociazione – 19 (18,0%) soggetti nel gruppo di controllo rispetto al gruppo principale – 6 (5,2%) (p=0,008), sia in combinazione con il virus di Epstein-Barr: 7 (14,0%) (gruppo di controllo) rispetto a 5 (4,3%) (gruppo principale) (p = 0,03). Sono state ottenute anche differenze significative nell'analisi della combinazione dell'HPV-18 con il citomegalovirus, che è stata riscontrata solo nel gruppo di controllo – 2 (4,0%) (p = 0,03).
Conclusione. L'analisi condotta suggerisce che la presenza del DNA dell'HPV, tipo 18, nelle cellule del carcinoma squamoso della mucosa della cavità orale potrebbe essere un fattore di decorso favorevole della malattia.
L'incidenza dei tumori maligni della mucosa orale, e soprattutto la mortalità dovuta a questa patologia, rimane ancora a un livello significativo sia nel mondo in generale che in Russia in particolare. Secondo i dati del MNIIOI intitolato a P.A. Herzen (filiale del FGBU "NMITs Radiologia" del Ministero della Salute della Russia), la mortalità annuale per questa patologia (secondo i dati del 2017) si avvicina al 50% di tutti i casi di malattia diagnosticati per la prima volta. La formazione morfologica del focolaio di carcinoma a cellule squamose della mucosa orale è un processo complesso e multilivello, e i fattori eziologici fondamentali per il suo sviluppo sono il fumo di tabacco, l'abuso di alcol e una scarsa igiene orale, che influenzano negativamente la struttura della normale mucosa, specialmente in individui con predisposizione genetica allo sviluppo di patologie oncologiche. Oltre ai noti fattori di rischio per l'insorgenza del carcinoma a cellule squamose della mucosa orale e alle malattie precoci registrate, esiste una serie di fattori, come le infezioni virali e l'infiammazione, che potrebbero rappresentare un importante anello nel patogenesi delle malattie maligne e potrebbero potenziare lo sviluppo del 15-20% dei tumori maligni.
Obiettivo della ricerca
Determinare la frequenza di rilevamento del DNA dei virus dell'herpes simplex di tipo I e II (HSV-I,II), del citomegalovirus (CMV), del virus di Epstein-Barr (EBV) e dei virus del papilloma umano di tipo 6, 11, 16 e 18 (HPV-6,11, HPV-16, HPV-18) nella mucosa normale della cavità orale e nelle lesioni di carcinoma a cellule squamose della mucosa della cavità orale.
Materiali e metodi di ricerca
Per raggiungere l'obiettivo prefissato è stato condotto uno studio prospettico, che ha incluso 50 volontari sani (gruppo di controllo), in osservazione presso la clinica di chirurgia maxillo-facciale e plastica dell'istituto di formazione superiore GBOU VPO con il nome dell'accademico I.P. Pavlov nel periodo dal 2012 al 2013 e 116 pazienti (gruppo principale), ai quali è stata per la prima volta verificata la diagnosi di "carcinoma a cellule squamose della mucosa della cavità orale" presso il GBUZ "Dispensario oncologico clinico della città" nel periodo dal 2012 al 2013. Il periodo totale di osservazione è continuato fino al 17.07.2019, dopo di che è stata effettuata l'analisi finale dei dati.
Criteri principali per l'inclusione dei pazienti con carcinoma squamoso della mucosa orale nello studio:
Firma del modulo di consenso informato volontario per partecipare allo studio.
Età superiore ai 18 anni.
Verifica morfologica della diagnosi di "carcinoma squamoso della mucosa orale".
Criteri principali per l'esclusione dei pazienti con carcinoma squamoso della mucosa orale dallo studio:
Metastasi a distanza di carcinoma squamoso della mucosa orale rilevate.
Criteri principali per l'inclusione nel gruppo di volontari sani:
Firma del modulo di consenso informato volontario per partecipare allo studio.
Età superiore ai 18 anni.
Assenza di malattie registrate al momento dell'inclusione nello studio della mucosa orale di natura infiammatoria, tumorale o di altro tipo.
Criteri principali per l'esclusione dal gruppo di volontari sani:
Verifica istologica della diagnosi di "carcinoma squamoso della mucosa orale".
Caratteristiche generali dei pazienti con carcinoma squamoso della mucosa orale.
Nel gruppo principale c'erano 77 uomini (66,38%) e 39 donne (33,62%). L'età media dei pazienti era di 60,80 ± 0,96 anni (IC 95% 58,90-62,70).
In 49 (42,24%) pazienti, il focolaio tumorale primario era localizzato nella parte anteriore e media della lingua, in 32 (27,60%) era la mucosa del pavimento della bocca. La mucosa della parte alveolare della mandibola era coinvolta in 8 (6,90%) pazienti, la guancia in 7 (6,03%) pazienti. Più raramente erano coinvolti il palato anteriore e la mucosa della piega pterigoidea - in 3 (2,59%) pazienti, il processo alveolare della mascella superiore, l'area retromolare e il palato duro - in 2 (1,72%) pazienti, e il palato molle e il labbro inferiore - in 1 (0,86%) paziente rispettivamente.
Le fasi iniziali della malattia (0, I e II) sono state diagnosticate in 24 (20,69%) pazienti (1,72%, 5,17% e 13,80% rispettivamente). In 18 (15,52%) pazienti è stata identificata la fase III della malattia, mentre più della metà dei pazienti – 68 (58,62%) – si è presentata inizialmente già con la fase IVA. In 6 (5,17%) pazienti il tumore primario è stato considerato inoperabile (T4b) o il coinvolgimento dei linfonodi regionali superava i 6 cm (N3) – fase IVB.
Lo studio istologico condotto ha rivelato che in 35 (30,17%) la differenziazione del tumore era alta (G1), in 34 (29,31%) era moderata (GII), mentre in 13 (11,21%) pazienti il grado di differenziazione del tumore era basso (GIII). In un terzo dei casi – 34 (29,31%) – il grado di differenziazione non è stato determinato.
In 51 (43,97%) casi sono stati riscontrati segni istologici di cheratinizzazione, in 29 (25,00%) casi il tumore non presentava segni di cheratinizzazione, in 5 (4,31%) il grado di cheratinizzazione è stato definito come parziale, mentre in 31 (26,72%) campioni la presenza di cheratinizzazione non è stata valutata.
Caratteristiche generali dei volontari sani.
Il gruppo di volontari sani era composto da 30 (60,0%) uomini e 20 (40,0%) donne. L'età media era di 55,7 anni (95% IC 47,60-61,35).
34 (68,0%) dei rispondenti hanno richiesto una consulenza per l'impianto dentale, 12 (24,0%) ai rispondenti è stata indicata una preparazione chirurgica per il trattamento ortodontico e 4 (8,0%) rispondenti sono stati consultati riguardo alla ritenzione/distrofia dei denti. I gruppi formati erano comparabili per indicatori demografici - sesso e età.
Metodo di rilevamento del DNA virale mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale.
Il prelievo del materiale è stato effettuato sotto anestesia locale infiltrativa dalla neoplasia primaria di pazienti con carcinoma squamoso della mucosa orale e delle gengive della mascella superiore o inferiore dei volontari sani; la dimensione del campione era di 0,5 x 0,5 cm. Dopo il prelievo, il campione è stato fissato in una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e congelato a una temperatura di -25 °C.
L'identificazione del DNA virale è stata effettuata mediante la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (Laboratorio di diagnostica molecolare GBOU VO PsPbGMU intitolato a I.P. Pavlov). Per l'identificazione qualitativa del DNA sono stati utilizzati kit diagnostici specializzati, secondo le istruzioni dei produttori. La sensibilità dei metodi PCR era standard di 102 copie geniche in un campione.
Metodologia di analisi statistica.
Le variabili che riflettono le caratteristiche sono state analizzate mediante statistica descrittiva. Al fine di determinare le categorie descrittive delle variabili quantitative, sono state valutate per normalità di distribuzione utilizzando il test di Shapiro-Wilk. In tutti i casi, i dati ottenuti seguivano una distribuzione normale, pertanto la loro descrizione è stata effettuata mediante media campionaria e errore medio (M ± m). Il confronto tra i gruppi di soggetti per la frequenza di occorrenza della caratteristica è stato effettuato utilizzando il criterio z (con correzione di Yates per la continuità). Tutti gli indicatori sono stati calcolati con un intervallo di confidenza (IC) bilaterale del 95% e un valore bilaterale di "p". L'elaborazione statistica è stata effettuata utilizzando il pacchetto di programmi applicativi Statistica® (StatSoft, ver. 12.0) e MedCalc® (ver. 19.0.7).
Risultati dell'analisi della frequenza di rilevamento del DNA virale mediante PCR in tempo reale
L'analisi condotta ha permesso di stabilire che la frequenza di assenza di DNA virale in entrambi i gruppi era la stessa, con 54 (46,6%) pazienti del gruppo principale nei quali non è stato rilevato DNA virale nella struttura tumorale, mentre nel gruppo di controllo il DNA virale era assente in 17 (34,0%) dei soggetti esaminati (p = 0,13). Nella restante coorte di soggetti esaminati, è stata registrata significativamente più frequentemente la presenza del DNA del virus di Epstein-Barr (EBV) – in 40 (34,48%) pazienti del gruppo principale (p < 0,0001) e in 15 (30,00%) volontari sani (p = 0,03). Il carcinoma squamoso della mucosa orale era significativamente più associato al DNA dei virus del papilloma umano sia in generale in 48 (41,4%) casi (p < 0,0001), sia per i sottotipi considerati: HPV-6,11 – 16 (13,8%) (p = 0,005), HPV-16 – 12 (10,3%) (p = 0,001), HPV-18 – 20 (17,2%) (p < 0,0001). Nel gruppo di controllo, il DNA HPV è stato rilevato significativamente più frequentemente solo in generale – 27 (54,0%) (p < 0,0001), e in HPV-18 – 24 (48,0%) (p < 0,0001).
L'analisi comparativa della frequenza di registrazione del DNA virale in entrambi i gruppi ha permesso di ottenere i seguenti risultati, presentati nella tabella 1.
Nel corso della nostra ricerca è stata riscontrata una frequenza significativamente più alta del DNA del HPV-18 nelle cellule della mucosa orale di volontari sani rispetto ai pazienti con carcinoma squamoso - nel gruppo di controllo, il HPV-18 è stato riscontrato 2,8 volte più frequentemente (p < 0,0001).
Tuttavia, è importante comprendere che il DNA di un solo tipo di virus nel gruppo principale è stato riscontrato solo in un terzo dei pazienti - 34 (29,3%), mentre nel gruppo di controllo - in 19 (38,0%) dei soggetti esaminati (p = 0,14). Due tipi di DNA virale sono stati registrati con la stessa frequenza sia nel gruppo principale - 24 (20,7%), sia nel gruppo di controllo - 14 (28,0%) (p = 0,16). L'associazione di tre o quattro tipi di DNA virale è emersa solo nei pazienti con carcinoma squamoso della mucosa orale - 3 (2,6%) e 1 (0,9%) (p = 0,26) (tab. 2).
I risultati dell'analisi secondaria delle combinazioni di virus nella struttura del carcinoma a cellule squamose e della mucosa orale normale hanno rivelato un'associazione significativamente più frequente della mucosa orale normale con HPV-18, sia in monoassociazione – 19 (18,0%) soggetti nel gruppo di controllo rispetto al gruppo principale – 6 (5,2%) (p = 0,008), sia in combinazione con il virus di Epstein-Barr: 7 (14,0%) (gruppo di controllo) rispetto a 5 (4,3%) (gruppo principale), (p = 0,03). Sono state inoltre ottenute differenze significative nell'analisi della combinazione di HPV-18 con il citomegalovirus, che è stata riscontrata solo nel gruppo di controllo – 2 (4,0%) (p = 0,03). D'altra parte, la combinazione di EBV con HPV-16 è stata registrata solo in 6 (5,2%) pazienti con carcinoma a cellule squamose della mucosa orale, con una tendenza a una maggiore frequenza di tale combinazione (p = 0,1).
Discussione
L'analisi che abbiamo condotto ha dimostrato in modo significativo che l'assenza di associazione della mucosa orale si verifica con la stessa frequenza sia nella mucosa invariata che nelle lesioni di carcinoma a cellule squamose, il che consente di parlare della comparabilità dei pazienti esaminati.
Nel corso della ricerca abbiamo registrato una maggiore frequenza di rilevamento del DNA del virus del papilloma umano di tipo 18 nella struttura della normale mucosa orale, sia in monoassociazione che in combinazione con altri tipi di virus (EBV, CMV). Studi simili e risultati analoghi, principalmente riguardo al VPH-18, sono stati ottenuti, ad esempio, da Yeudall W. A. e Campo M. S. (Regno Unito) nel 1991: utilizzando la PCR hanno analizzato 25 campioni di normale mucosa orale, in cui è stato possibile rilevare il DNA del VPH-18 nell'8%, mentre nella struttura del carcinoma a cellule squamose il DNA del VPH-18 è stato rilevato nel 20,5% dei casi su 39 esaminati. Tuttavia, i dati della letteratura sono ambivalenti: ad esempio, Saghravanian
N. e collaboratori (Iran) nel 2011 hanno analizzato 18 campioni di normale mucosa e 21 campioni di carcinoma a cellule squamose della mucosa orale e hanno rilevato che nella mucosa non alterata il DNA del VPH-16 e del VPH-18 non è stato trovato in nessun campione, mentre nei focolai di carcinoma a cellule squamose sono stati riscontrati 3 (14,3%) risultati positivi per questi tipi di virus. Nel 2017 Liu T. e collaboratori (Cina) hanno analizzato, mediante analisi immunoistochimica, la frequenza di associazione in 22 campioni di normale mucosa orale e in 6 campioni di carcinoma a cellule squamose con VPH di tipo 16 e 18, dove il DNA dei virus è stato rilevato nel 62,5% dei casi nel gruppo di volontari sani e in tutti e 6 (100%) i pazienti con oncopatologia. I risultati della nostra ricerca mostrano in modo significativo che il carcinoma a cellule squamose della mucosa orale è più frequentemente associato al DNA dei virus del papilloma umano sia in generale nel 41,4% (48) dei casi, sia per singoli sottotipi virali: VPH-6,11 – 13,8%, VPH-16 – 10,3%, VPH-18 – 17,2%, mentre nella normale mucosa il DNA del VPH è stato rilevato significativamente più spesso solo in combinazione – 54,0% e nel caso del tipo VPH-18 – 48,0%, rispetto agli altri sottotipi, che si sono presentati significativamente meno frequentemente.
Le ricerche russe dedicate alla questione in esame sono estremamente rare, si può dire che siano isolate e il numero di pazienti esaminati in tali studi è esiguo. Uno degli ultimi studi è il lavoro di Kiryanov S. A. con i coautori, presentato alla fine del 2019: gli autori hanno esaminato 10 pazienti con carcinoma squamoso della mucosa orale per la presenza di DNA del HPV e dell'EBV mediante la reazione PCR in tempo reale, e hanno scoperto che il DNA del HPV non era presente in nessun campione di tessuto tumorale, mentre il DNA dell'EBV è stato rilevato in 7 (70,0%) casi. Nel nostro studio, il DNA del virus di Epstein-Barr (EBV) è stato trovato solo nel 34,48% (40) dei pazienti con carcinoma squamoso della mucosa orale e nel 30,00% (15) dei volontari sani.
L'analisi dei dati ottenuti suggerisce che la rilevazione del DNA del HPV di tipo 18 nelle cellule del carcinoma squamoso della mucosa orale potrebbe essere un fattore di decorso favorevole della malattia, e i tassi di sopravvivenza e l'efficacia del trattamento antitumorale in questo gruppo di pazienti prevalgono rispetto ai tassi analoghi dei pazienti negativi per HPV-18. Pertanto, la conduzione del nostro studio su un significativo materiale clinico potrebbe, in un certo senso, offrire una nuova prospettiva sui virus come fattore eziologico affidabile nello sviluppo del carcinoma squamoso della mucosa orale. A nostro avviso, particolare attenzione dovrebbe essere dedicata all'associazione del carcinoma squamoso della mucosa orale con l'HPV-18, come probabile fattore eziologico nello sviluppo della degenerazione maligna delle strutture della mucosa orale. Tuttavia, è indubbio che sia necessaria un'ulteriore e approfondita indagine su questa questione, al fine di determinare il reale ruolo del fattore virale nello sviluppo e nel decorso del carcinoma squamoso della mucosa orale.
Kutukova S.I., Chukhlovin A.B., Yaremenko A.I., Ivaskova Y.V., Razumova A.Y., Ermakova T.S.
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